利多卡因对哮喘小鼠肺部炎症的影响及机制研究

发布时间：2020-04-23 16:43

【摘要】：支气管哮喘是以气道炎症为主要病理特征的气道疾病之一。近20年来,支气管哮喘的发病率持续增加,全球支气管哮喘患者人数已逾3亿。研究发现TLR2信号通路调控炎症因子释放,参与哮喘的发病机理。利多卡因可以明显改善哮喘患者的气道炎症,减少激素的使用。本研究中,我们采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,在细胞水平观察利多卡因对金葡菌诱导的RAW264.7细胞TLR2表达的影响。然后以OVA致敏和激发的过敏性小鼠为研究对象,观察利多卡因对过敏性小鼠肺部炎症及肺组织内TLR2表达的影响。同时我们使用了TLR2激动剂预处理的野生型小鼠及TLR2基因敲除小鼠,进一步探讨雾化吸入利多卡因抑制过敏性气道炎症的机制。研究目的1、研究利多卡因对金葡菌感染的巨噬细胞TLR2及下游潜在信号级联活化的影响。2、研究雾化吸入利多卡因对过敏性小鼠肺组织炎症及TLR2信号通路的影响。3、研究利多卡因对过敏性小鼠炎症小体活化的影响。研究方法1、检测利多卡因对金葡菌感染的巨噬细胞TLR2信号通路活化的影响小鼠单核巨噬细胞RAW264.7以2.5×105/孔的密度种植于12孔细胞培养板中,采用不同浓度的利多卡因预处理24h,金葡菌刺激1h后收取培养上清液和细胞。采用免疫印迹法检测TLR2及下游蛋白的表达;2、雾化吸入利多卡因对过敏性小鼠肺部炎症及肺内TLR2蛋白表达的影响C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组(Con组),哮喘组(OVA组),利多卡因治疗组(OVA+1%Lido组)。留取小鼠肺组织及肺泡灌洗液。HE及PAS染色观察小鼠气道炎症、杯状细胞及粘液分泌情况;瑞士吉姆萨染色计数肺泡灌洗液中的炎症细胞数目;ELISA试剂盒检测小鼠肺泡灌洗液中IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度;免疫印迹法检测肺组织中TLR2蛋白表达水平。3、雾化吸入利多卡因对Pam3CSK4预处理的过敏性小鼠肺部炎症的影响致敏及激发前2h腹腔注射TLR2激动剂Pam3CSK4预处理C57BL/6雌性小鼠。留取肺泡灌洗液及肺组织标本。HE及PAS染色观察小鼠气道炎症、杯状细胞及粘液分泌情况;瑞士吉姆萨染色计数肺泡灌洗液中的炎症细胞数目;ELISA试剂盒检测小鼠肺泡灌洗液中IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度;免疫印迹法检测肺组织中TLR2蛋白表达水平。4、雾化吸入利多卡因对TLR2基因敲除过敏性小鼠肺部炎症的影响OVA致敏和激发TLR2基因敲除小鼠建立模型,留取小鼠肺组织及肺泡灌洗液。HE及PAS染色观察小鼠气道炎症、杯状细胞及粘液分泌情况;瑞士吉姆萨染色计数肺泡灌洗液中的炎症细胞数目;ELISA试剂盒检测小鼠肺泡灌洗液中IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的浓度;免疫印迹法检测肺组织中TLR2蛋白表达水平。5、雾化吸入利多卡因对过敏性小鼠炎症小体活性的影响OVA致敏和激发野生型小鼠。留取小鼠外周血、肺组织及肺泡灌洗液。小鼠血细胞计数仪检测小鼠外周血白细胞计数及分类计数;ELISA试剂盒检测小鼠肺泡灌洗液及血清中IL-4、IL-18和Ig E的浓度;免疫印迹法检测肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。研究结果1、利多卡因抑制金葡菌诱导的巨噬细胞TLR2信号通路活化小鼠单核巨噬细胞系在金葡菌刺激下TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表达明显增高,利多卡因呈浓度依赖性的抑制TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表达,且此抑制作用在利多卡因浓度为200μg/ml组最显著。2、雾化吸入利多卡因显著抑制OVA诱发的气道炎症及肺内TLR2的表达与Con组相比,OVA刺激后,小鼠支气管周围炎症细胞浸润,管壁增厚,部分小气道塌陷,粘膜下上皮杯状细胞增生,粘液分泌增加,肺泡灌洗液中炎症细胞及IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平显著升高。与OVA组相比,雾化吸入利多卡因显著降低小鼠肺组织支气管周围炎症细胞浸润,杯状细胞及粘液分泌明显减少,肺泡灌洗液中的炎症细胞及炎症因子浓度显著下调。与Con组相比,OVA刺激后小鼠肺组织内的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表达均明显升高,雾化吸入利多卡因明显降低哮喘小鼠肺组织内的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表达。3、雾化吸入利多卡因明显抑制Pam3CSK4预处理的过敏性小鼠肺部炎症Pam3CSK4预处理显著加重野生型过敏性小鼠的肺部炎症,主要表现在小鼠支气管周围炎症细胞浸润程度、粘膜下上皮杯状细胞增生及粘液分泌量、肺泡灌洗液中炎症细胞及炎症因子浓度均较未经Pam3CSK4预处理的过敏性小鼠显著增高。雾化利多卡因能彻底抑制OVA激发的Pam3CSK4预处理的过敏性小鼠肺部炎症。Pam3CSK4预处理显著提高过敏性小鼠肺组织内的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表达,雾化吸入利多卡因彻底抑制Pam3CSK4预处理的过敏性小鼠肺组织内的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表达。4、雾化吸入利多卡因不能进一步抑制OVA诱导的TLR2基因敲除小鼠肺部炎症OVA致敏激发后,TLR2-/-小鼠与野生型小鼠相比,支气管周围炎性细胞浸润,上皮下杯状细胞增生,粘液分泌等气道炎症表现均明显减弱,肺泡灌洗液中炎性细胞数量明显减少,IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ表达明显下调。而雾化吸入利多卡因则不能进一步降低OVA刺激的TLR2-/-小鼠肺部炎症。OVA致敏激发后,TLR2-/-小鼠与野生型小鼠相比,肺组织中的NF-κBp65和NLRP3蛋白的表达水平减弱。雾化吸入利多卡因则不能进一步降低肺组织中NF-κBp65和NLRP3蛋白的表达水平。5、雾化吸入利多卡因仅抑制过敏性小鼠肺组织中NLRP3和ASC的表达与Con组相比,OVA刺激后,小鼠外周血白细胞总数及淋巴细胞数明显增高,肺泡灌洗液中IL-4水平及血清中Ig E水平明显增高。与OVA组相比,雾化吸入利多卡因显著降低小鼠外周血白细胞总数及淋巴细胞数,且肺泡灌洗液中IL-4水平及血清中Ig E水平明显著下调。与Con组相比,OVA刺激后小鼠肺组织内的NLRP3和ASC的表达均明显升高,但肺组织中caspase-1和IL-1β蛋白的表达以及BALF中IL-18的水平并没有明显增加。雾化吸入利多卡因明显降低哮喘小鼠肺组织内的NLRP3和ASC的表达。研究结论1、利多卡因抑制金葡菌诱导的RAW264.7细胞TLR2信号通路的活化。2、雾化吸入利多卡因通过抑制TLR2信号通路活化来降低小鼠变应性气道炎症。3、利多卡因抑制Th2应答和NLRP3表达改善哮喘小鼠的气道炎症。
【图文】：

1h时TLR2信号通路活化明显），，然后采用Western Blot的实验方法检测蛋白表达水平。NF-κ Bp65在TLR2信号通路中起到关键性作用。TLR2激活后活化NF-κ Bp65，活化的NF-κ Bp65能够激活下游的NLRP3，从而放大炎症级联[14]。如图1（A-D）所示，金葡菌刺激RAW264.7细胞诱导了TLR2、NF-κ Bp65和NLRP3的活化，而利多卡因呈浓度依赖性的抑制TLR2信号通路的活化，在200 ng/ml浓度时对TLR2信号通路抑制最显著。

发现Pam3CSK4预处理能显著提高金葡菌诱导的TLR2信号通路的活化，而200μg/ml的利多卡因预处理降低了Pam3CSK4增强的TLR2，P-NF-κBp65和NLRP3的表达（图2A-D）。图 2 利多卡因明显抑制TLR2激动剂Pam3CSK4及金葡菌诱导的RAW264.7细胞TLR2信号通路的活化。（A）TLR2激动剂Pam3CSK4（1μg/ml）及200ng/ml的利多卡因预处理RAW264.7细胞24小时，再给予RAW264.7细胞金葡菌刺激1小时。收集
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25

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