星状神经节嘌呤2受体参与糖尿病心脏自主神经病变的机制研究

发布时间：2020-04-25 11:13

【摘要】：研究背景:糖尿病作为一种全球性的慢性疾病,严重影响着人们的健康和生活质量。糖尿病长期高血糖可导致各种器官系统损害和严重的并发症。其中,糖尿病心脏自主神经病变(Diabetic cardiac autonomic neuropathy,DCAN)是其常见的并发症,往往被忽视和误诊。它的发病机制尚不清楚,可能是多种因素导致。自主神经节包括交感神经节和副交感神经节。星状交感神经节的神经纤维可分布至心神经丛影响心脏的活动。外周交感神经节神经元的胞体被周围的卫星胶质细胞(Satellite glial cells,SGCs)紧密地包围。SGCs是伤害性信号传递通路中的重要部位,神经元-SGCs的异常相互作用涉及外周交感神经的病理变化。外界的伤害性刺激可引起神经元释放的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)增加,ATP作为神经递质能够作用于神经元和胶质细胞上嘌呤2(P2)受体,P2受体包含P2X和P2Y受体,已有研究表明P2X受体相关亚型参与自主神经病变过程。我们之前的研究发现颈部交感神经节与糖尿病心脏自主神经病变有关,但交感神经节在糖尿病心脏自主神经病变中详细作用机理尚不清楚。目的:通过建立2型糖尿病大鼠模型,探究星状神经节P2嘌呤受体在2型糖尿病心脏自主神经病变中的作用及其机制。方法:建立2型糖尿病大鼠模型,并随机将大鼠分为五组:对照组(Ctrl)、2型糖尿病模型组(Diabetes Mellitus,DM)、模型合并P2X_3短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)处理组(DM+P2X_3 shRNA)、模型合并P2Y_(12) shRNA处理组(DM+P2Y_(12)2 shRNA)及模型合并空载质粒处理组(即模型合并阴性对照处理组:DM+Negative Control,DM+NC shRNA)。实验内容:(1)各组大鼠心率、血压、心率变异性变化的检测;(2)酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组大鼠血清中肾上腺素的含量;(3)Real-time PCR和蛋白印迹方法检测各组大鼠星状神经节(SG)中P2Y_(12)受体mRNA和蛋白水平表达变化;(4)免疫荧光双标法检测各组实验大鼠SG中P2Y_(12)受体与卫星胶质细胞标记物谷氨酰氨合成酶(GS)的共表达;(5)Real-time PCR、蛋白印迹和免疫组织化学方法检测各组大鼠SG中P2X_3受体表达变化;(6)Real-time PCR和蛋白印迹检测炎性因子白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达变化;(7)Real-time-PCR和蛋白印迹检测缝隙连接蛋白Cx43表达的变化;(8)电镜检测正常组和2型糖尿病模型大鼠SG中缝隙连接(Gap Junctions,GJs)的变化,了解糖尿病损伤是否导致缝隙连接(GJs)介导的耦联增加;(9)蛋白印迹检测p38的磷酸化水平。结果:(1)DM组大鼠的血压和心率均明显高于Ctrl组(p0.01),P2X_3shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理七天后大鼠血压和心率均较DM组明显降低(p0.01),DM+NC shRNA组大鼠血压和心率与DM组无明显差异(p0.05);心率变异性结果显示:DM组大鼠的心率变异性明显低于Ctrl组(p0.01),P2X_3shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理七天后大鼠心率变异性均较DM组明显升高(p0.01),DM+NC shRNA组大鼠心率变异性与DM组无明显差异(p0.05);(2)ELISA结果显示,与Ctrl组相比,DM组血清肾上腺素浓度增加,P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理后血清肾上腺素浓度降低(p0.01),DM+NC sh RNA组血清肾上腺素和DM组之间无明显差异(p0.05);(3)Real-time PCR和蛋白印迹方法检测各组大鼠星状神经节中P2Y_(12)受体mRNA和蛋白变化结果显示:与Ctrl组相比,DM组大鼠SG中P2Y_(12) mRNA和蛋白水平表达均明显高于Ctrl组(p0.05),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理七天后大鼠SG中P2Y_(12)受体mRNA和蛋白表达均较DM组明显降低(p0.05),DM+NC shRNA组与DM组相比无明显差异(p0.05);(4)免疫荧光双标结果表明SG中P2Y_(12)受体与SGCs标志物谷氨酰氨合成酶(GS)共表达,DM和DM+NC shRNA组大鼠P2Y_(12)受体与GS的共表达荧光强度高于Ctrl组,DM+P2Y_(12)2 shRNA组和DM+P2X_3shRNA组P2Y_(12)受体与GS的共表达荧光强度低于DM组;(5)Real-time PCR、蛋白印迹和免疫组织化学方法检测各组大鼠SG中P2X_3受体表达变化结果显示星状神经节P2X_3受体在DM组表达高于Ctrl组(p0.01),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)shRNA处理后大鼠SG中P2X_3受体表达均降低(p0.01),DM组和DM+NC shRNA组相比无明显区别(p0.05);(6)Real-time PCR和蛋白印迹方法检测各组大鼠星状神经节中炎性因子IL-1β和TNF-α表达变化,与Ctrl组相比,DM组大鼠SG中IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表达均明显高于Ctrl组(p0.01),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理七天后大鼠SG中IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表达均较DM组明显降低(p0.01),DM+NC shRNA组与DM组相比无明显差异(p0.05);(7)Real-time PCR和蛋白印迹检测缝隙连接蛋白Cx43表达的变化结果显示:与Ctrl组相比,DM组大鼠SG中Cx43 mRNA和蛋白表达均明显高于Ctrl组(p0.05),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理后大鼠SG中Cx43mRNA和蛋白表达水平均较DM组明显降低(p0.01),DM+NC sh RNA组与DM组相比无明显差异(p0.05);(8)电镜结果显示,与Ctrl组相比,DM组SGCs间缝隙连接增多,细胞间耦联增强;(9)与Ctrl组相比,DM组p38磷酸化水平升高(p0.01),P2X_3 shRNA或P2Y_(12)2 shRNA处理后p38的磷酸化水平均下降(p0.01),DM组和DM+NC shRNA组之间无明显差异。结论:星状神经节P2受体参与2型糖尿病大鼠心脏自主神经病变(DCAN)的病理变化过程,其机制可能与神经元与神经胶质细胞之间相互作用及p38MAPK信号通路的激活有关。P2Y_(12) shRNA和P2X_3 shRNA可缓解2型糖尿病大鼠心脏自主神经病变。
【图文】：

第 3 章 实验结果受体的表达 Real-time PCR 和 Western blotting 检测各组大鼠星状神经节中变化。实验结果显示：与 Ctrl 组相比，DM 组大鼠星状神经明显升高（p < 0.01）；与 DM 组相比，DM+P2Y12shRNA 组、D组 P2Y12受体表达明显降低（p < 0.05）；DM 组与DM+NC shRNA无明显差异(p > 0.05)（见图 1）。鼠星状神经节P2Y12受体表达的变化eal-time PCR 和 Western blotti ng 检测各组大鼠星状神

表明 P2Y12受体表达在星状神经节卫星胶质细胞。（见图2）。3.3 大鼠星状神经节P2Y12受体表达的变化3.3.1 Real-time PCR 和 Western blotti ng 检测各组大鼠星状神经节中
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2

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本文编号：2640185