G-蛋白偶联受体65基因SNPs与中国汉族人群强直性脊柱炎的关联性研究

发布时间：2020-04-28 01:45

【摘要】：目的:强直性脊柱炎(Ankyloaing Spondylitis,AS)是一种慢性炎症性自身免疫疾病,可以累及患者多种组织,导致患者脊柱活动度受限,甚至残疾。基因研究已经证实AS与炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)存在风险致病基因重叠现象。越来越多的研究表明G-蛋白偶联受体65(G protein coupled-receptor 65,GPR65)与IBD遗传易感性有关联。本研究旨在探究GPR65基因上两个标签单核苷酸多态性(Tag single nucleotide polymorphisms,tag SNPs)(rs68177277、rs11624293)与中国汉族人群AS疾病易感性的关联;同时分析位点基因型分布与AS临床表型(血沉,C-反应蛋白等)之间的关联。方法:采用病例—对照研究设计,病例来自于安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科门诊,由具有副主任医师及以上职称的风湿科医生参照1984年修订的纽约标准明确诊断为AS,共收集700例强直性脊柱炎患者;按照频数匹配的方式,从合肥市血站收集700例年龄、性别匹配的健康个体作为对照纳入本次研究。使用Haploview 4.2软件,从GPR65基因上筛选出两个tag SNP位点(rs68177277、rs1162429);采用SNPscan技术对rs68177277和rs11624293位点进行基因分型。采用?~2检验比较两个位点的基因型和等位基因频率在AS患者与健康对照之间的分布情况,并采用二分类Logistic回归模型校正年龄、性别,分析两个位点基因型和等位基因频率与AS遗传易感性的关联。同时,构建基因位点的显性遗传模型,隐性遗传模型和超显性遗传模型,分析两个位点不同基因型在AS患者和健康对照之间的分布情况。基于AS在不同性别间发病率存在差异,以性别为分层因素进行分层分析。最后,采用Kruskal-Wallis H检验分析位点基因型分布与AS疾病表型(血沉,C-反应蛋白,BASDAI,BASFI,指地距和枕墙距)之间的关联。此外,以BASDAI得分将患者划分为疾病缓解期AS患者和疾病活动期AS患者,并且分别比较不同疾病活动度下位点基因型分布与BASFI和BASDAI得分的关联性。定量资料如果符合正态分布采用均数±标准差描述,反之,描述时则采用中位数(四分位数间距);定性资料采用频数(n,%)描述。所有统计分析均在SPSS 17.0软件中完成,检验水准设定为双侧0.05;SNP位点的多重比较使用Bonferroni法进行检验水准校正。结果:在基因分型试验中,共有40份血样分型失败,分型成功率为97.1%,最终分别有673例AS患者和687例健康对照的数据纳入本次分析。强直性脊柱炎患者和健康对照的平均年龄分别为28.62±7.76岁和28.58±9.31岁;性别比(男/女)分别为548/125和560/127。AS患者的中位病程为3.3(0.8,8.0)年;HLA-B27的阳性率为61.4%;AS患者的BASFI得分为0.90(0.00,2.60),BASDAI得分为2.00(0.60,3.80);按照BASDAI≥4的标准,仅发现23%的AS患者(152人)处于疾病活动期。遗传平衡检验结果表明rs68177277和rs1162429位点在对照人群中均符合哈迪-温伯格平衡(P=0.1822;P=0.9434)。基因分型结果显示:在GPR65基因上的两个SNPs中,仅rs11624293位点的基因型和等位基因频率分布在AS患者和健康对照间存在统计学差异(P=0.004;P=0.002),经Bonferroni法校正后差异仍具有统计学意义;按性别进行分层分析,结果显示:基因型和等位基因频率分布仅在男性患者和男性健康对照之间具有统计学差异(P=0.013;P=0.010),而在女性患者和女性健康对照之间未观察到统计学差异(P=0.188;P=0.062)。进一步校正年龄、性别后,Logistic回归模型分析结果显示:携带rs11624293-C/T基因型和rs11624293-C等位基因的个体患AS的危险性分别是携带rs11624293-T/T基因型和rs11624293-T等位基因个体的1.527倍和1.515倍(OR=1.527,95%CIs:1.190-1.958;OR=1.515,95%CIs:1.183-1.942)。不同遗传模型分析的结果表明:rs11624293位点在显性和超显性基因模型下的基因型分布在AS患者和健康对照之间的差异均具有统计学差异(显性模型χ~2=11.169,P=0.001;超显性模型:χ~2=10.793,P=0.001)。经性别分层后,我们观察到:仅在男性AS患者和男性健康对照之间rs11624293位点的显性模型(P=0.004)和超显性模型(P=0.003)分布具有统计学差异,而在女性AS患者和女性健康对照之间未观察到统计学差异。临床表型分析结果显示AS患者的ESR,CRP,BASDAI,BASFI等临床指标在rs11624293位点的三个基因型间不具有统计学差异(P0.05)。此外,以BASDAI得分进行分层分析,结果显示:疾病缓解期AS患者的BASFI得分在rs11624293位点的三个基因型间具有统计学差异(P=0.007)。结论:GPR65基因rs11624293位点的C等位基因以及C/T基因型可能是AS发病的危险因素,并且该位点对疾病易感性的影响在男性人群中更为显著。此外,该位点的基因型可能会影响AS患者的疾病严重程度。
【图文】：

基因分型 试验原理本次研究中基因分型方法采用的是由天昊公司研发的 SNPscanTM基因简洁地说，，SNPscan 分型的技术原理为：首先，采用连接酶连接反应找上候选 SNP 位点的等位基因；然后在设计的探针末段加上由不同数构成的非特异片段，同时通过连接酶加接反应，继而获得各个位点相片段；以荧光标记的通用引物为基础对连接产物进行 PCR 扩增，通的 DNA 产物进行分离；最后，根据电泳图谱得到候选 SNP 的基因型第一次评估 修改后评估图 1. GPR65 基因连锁不平衡图谱Fig1. Pair-wise LD plot for GPR65 gene variants

20图 2. SNPscanTMSNP 分型流程图Fig2. Flow plot of SNPscanTM6.2 主要实验试剂本次研究中 DNA 提取所用到的试剂主要包括：由上海生化提供溴化乙啶试剂溴酚兰试剂；Qiagen 公司研制的 Hotstar Taq 试剂盒； NEW ENGLAND 生物科公司销售的 PCR Marker；SNaPshot Multiplex, 5X Sequencing Buffer, HI-DI,eneScanTM-120 (ABI)；SAP (Promega)；EXOI (Epicentre)等试剂。除此之外，上生化公司为我们提供了引物设计服务。6.3 主要试验仪器DNA 提取中用到的仪器主要包括：DK-8D 型电热恒温水槽、电热恒温鼓风干
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.23

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本文编号：2642906