干细胞动员在胫骨横向搬移治疗重度糖尿病足机制中的作用研究

发布时间：2020-05-20 19:41

【摘要】：背景我国约有糖尿病患者1.14亿人,糖尿病足是该人群最常见的并发症,患病率约有25%。糖尿病足是糖尿病长期外周神经和微血管病变在下肢及其足部损伤的表现,主要表现为体表溃疡或深部多种组织损伤,多伴发感染或更为严重的并发症。目前糖尿病足采用综合治疗方式,但重度糖尿病足愈合不理想,甚至可引起截肢,且截肢风险极高。因此,在糖尿病足患者治疗中,如何提高创面愈合率和保肢一直是临床面临的难题。另一方面,导致慢性创面的病因中,糖尿病引起的下肢溃疡占比高达33.3%,解决糖尿病足的创面问题,同样有助于慢性创面的修复治疗。根据“张力-应力”法则建立的Ilizarov外固定架骨搬移治疗体系,早期多用于创伤、慢性骨髓炎引起的大段骨缺损,获得良好的缺损骨段修复效果。我们利用外固定架骨搬移中胫骨横向骨搬移技术用于重度糖尿病足的治疗,使得创面愈合率大大提升并极大的降低了截肢率,还发现创面为再生性修复。胫骨横向骨搬移部位和溃疡部位不在同一部位,甚至在对侧下肢或足部,但是依然获得非常好的溃疡愈合疗效,提示胫骨横向骨搬移的局部损伤刺激,可能产生全身性活化与修复效应。回顾机体修复经典相关理论,结合胫骨横向骨搬移技术促进溃疡创面的再生羽和现象,提示其中机理可能涉及机体动员相关生长因子和干细胞的活化动员。其中干细胞的分泌、活化及多向分化性可能参与具体组织结构塑性与修复。干细胞理论表明,机体各组织器官有不同层次的干细胞,骨髓是体内最大的干细胞库。通常生理状态下,骨髓干细胞大多处于静止状态,外周血和循环中仅少量干细胞存在,当组织、器官受损时,可通过SDF-1等干细胞动员因子,活化与趋化骨髓干细胞归巢至损伤部位,并通过损伤部位微环境诱导调节,使损伤部位得以修复。方法1.收集2016年6月至2019年3月于广西医科大学第一附属医院骨关节科住院的重度糖尿病足患者,筛选其中136例,通过临床观察重度糖尿病足下肢创面愈合过程,进一步明确胫骨横向骨搬移促进重度糖尿病足溃疡再生修复现象,统计愈合率、截肢率等,同时分析并总结单侧搬移双侧下肢创面修复以及健侧搬移患侧下肢创面修复的临床案例,并通过血流指标(足背动脉搏动情况及足部皮温)、下肢周围神经病变指标(TCSS评分和10g尼龙丝实验)明晰胫骨横向骨搬移的全身性再生修复效应。2.征求患者同意后,选择2例重度糖尿病足背景纯净患者,于术前及术后1月取其外周血,提取血清,进行GSH-CAA-X00芯片检测,寻找干细胞动员相关因子变化。3.基于芯片结果,征求患者同意后,选择10例重度糖尿病足患者,于术前及术后1月取其肝素抗凝外周血,提取外周血单个核细胞,以鼠抗人单克隆CD34抗体,鼠抗人单克隆CXCR4抗体共同标记,探索造血干细胞CD34~+CXCR4~+亚群的改变规律。4.基于芯片结果,征求患者同意后,选择10例重度糖尿病足患者,其中5人与进行流式检测患者重复,包括两名芯片检测患者,于术前及术后1月取其肝素抗凝外周血,提取外周血单个核细胞,并配置2×10~4个/ml浓度的细胞悬液,接种于甲基纤维素培养基中培养14天,计数不同类型造血干细胞克隆集落数目,进一步明确造血干细胞在外周血中的改变规律。5.征求患者同意后,选择40例重度糖尿病足患者,包括上述实验患者,于术前及术后1月取其创面边缘组织,制成组织切片并行HE染色,镜下观察术后愈合情况。6.征求患者同意后,选择40例重度糖尿病足患者同上,于术前及术后1月取其创面边缘组织,制成组织切片并用免疫组织化学技术,以CK19标记表皮干细胞,Ki-67标记增殖状态细胞,检测手术前后CK19与Ki-67阳性细胞的数量与分布。结果1.总计136例重度糖尿病足患者中除5例急性下肢血栓形成紧急截肢外,溃疡创面愈合率100%,保肢率96.3%,创面3至8个月可再生性修复愈合,原创面皮肤皮纹与正常皮肤基本一致,仅留线性疤痕。患肢疼痛、感觉等均有恢复,可独立行走2000m。患者随访3-24个月,仅出现4例复发。术后患者足背动脉搏动情况得到改善;足部皮温恢复升高,p0.05,术后患者下肢血流状况得到改善;术后TCSS评分降低,p0.05,;10g尼龙丝测试有感觉的点数增加,p0.05,术后患者下肢周围神经病变得到改善。2.GSH-CAA-X00芯片结果显示,与术前相比,术后干细胞动员相关趋化因子中,SDF-1、Mip-a、IL-8 foldchange1.2,结果显示上调;干细胞动员相关细胞因子中G-CSF、GM-CSF、SCF、IL-3、IL-7 foldchange1.2,结果显示上调。3.与术前相比,术后外周血造血干细胞CD34~+CXCR4~+亚群比例上升,p0.05。4.术后外周血造血干细胞克隆集落形成数量增加,p0.05。5.术前创面边缘组织HE染色镜下显示表皮结构不完整,坏死结构较多,术后1月创面边缘组织可清晰的观察到完整表皮层结构,包括角质层、颗粒层、棘层和基底层,镜下可观察到血管和胶原纤维,纤维结构少见;术前与术后创面边缘组织均有大量炎性细胞浸润。6.术前Ki-67阳性细胞主要分布于基底层,量少;术后Ki-67阳性细胞于基底层处增多,且广泛分布于真皮层中。CK19阳性细胞术前表达量较少,术后表达增多,成团状分布于真皮层中。结论1.胫骨横搬技术可以促进重度糖尿病足患者溃疡创面再生性愈合。2.胫骨横搬技术可能通过动员和激活机体干细胞(如骨髓干细胞、表皮干细胞等),促进创面皮肤细胞增殖,参与了重度糖尿病足患者创面愈合机制。
【图文】：

下肢,足部,同侧,单侧

图 1-1 单侧搬移同侧下肢、足部创面变化Figure 1-1 Unilaterally moving the ipsilateral lower extremity and foot healing: A: Before theoperation; B: After 1m; C: After 6w; D: After 3m; E: After 5m; F: After 9m;图 1-1 单侧搬移同侧下肢、足部愈合情况A 搬移术前B 搬移术后 1mC 搬移术后 6wD 搬移术后 3mE 搬移术后 5mF 搬移术后 9m

下肢,单侧,同侧,双侧

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