L-型钙通道在氟致PC12细胞损伤中的作用及分子机理的研究

发布时间：2020-06-01 16:40

【摘要】：氟元素(F)具有极强的氧化能力,是典型的负电性元素,是最活泼的非金属元素,可以直接或间接地与几乎所有元素化合生成相应的氟化物,主要以无机氟化物的形式存在于自然界中。氟几乎存在于人类生活环境的各个方面,但机体摄入氟的主要途径是饮水、食物和空气。机体长期摄入过量氟,致使氟在体内蓄积过多,引起机体损伤,称为地方性氟中毒,简称地氟病。氟中毒对机体骨相器官和非骨相器官都具有明显的损害,但具体机制尚未明了。近年来,有关氟中毒的“钙矛盾疾病”的研究逐渐成为热点。钙离子通道作为跨越细胞膜的一组蛋白质大分子,严格控制着钙离子进入细胞的过程,钙离子通道活性的变化可能是神经细胞凋亡的启动机制之一,因此研究氟作用条件下神经细胞的钙稳态变化在氟中毒的发病机制研究中非常必要。L型钙离子通道是控制钙离子内流的主要通道,参与细胞质内钙离子水平,参与神经细胞钙稳态、突触可塑性、学习记忆等功能调节。PC12细胞来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤,经神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导,可增殖、分化为有交感神经元特性的细胞,被广泛用于神经系统疾病的体外研究项目中。本实验采用PC12细胞高氟(5.0mM)/低氟(0.5mM)暴露,首次采用高氟/低氟联合L型钙离子通道激动剂FPL64176(0.5umol/L)/拮抗剂Nifedipine(0.2umol/L)(对照组、高氟组、低氟组、高氟+激动剂组、高氟+拮抗剂组、低氟+激动剂组、低氟+拮抗剂组)暴露后,在不同的作用时间段(2、4、6、8、10、12和24h)用cck-8检测PC12细胞活力;氟暴露2h后,用DCF荧光染色标记检测PC12细胞内活性氧;用Hoechst-33342检测PC12细胞凋亡的情况:氟暴露24h后,用倒置光学显微镜直接观察PC12细胞形态改变,应用RT-PCR/westem blot方法检测PC12细胞L型钙离子通道Cav1.2及下游相关基因/蛋白CAMKⅡ、c-fos、Bax、bcl-2的表达情况。探讨L-型钙通道在氟致PC12细胞损伤中的作用及分子机理,这对于进一步探究地氟病的发病机制及防治方法具有重要的科学价值和临床意义。染氟2/4/6/8/10/24h后,HF组细胞存活率较对照组显著(P0.05)或极显著下降(P0.01);染氟2/4/6/8/10h后,HF+N组细胞存活率较显著上升(P0.05)。PC12细胞呈长梭形,染氟24h后,HF组细胞密度减小,部分细胞开始收缩变圆,凋亡细胞数目增多,有的甚至可以看到细胞碎片;HF+N组凋亡细胞数目较HF组明显变少。染氟组细胞内钙离子/细胞内活性氧/细胞凋亡水平显著(P0.05)或极显著(P0.01)上升,HF+P/LF+P组细胞内钙离子/细胞内活性氧显著上升(P0.05)或极显著上升(P0.01),HF+N/LF+N组细胞内钙离子/细胞内活性氧水平显著下降(P0.05)或极显著下降(P0.01)。L-型钙离子通道及下游相关基因/蛋白表达检测结果显示,HF组Cav1.2基因/蛋白、CAMKⅡ基因表达水平较对照组极显著下降(P0.01),c-fos基因、Bax/bcl-2基因/蛋白比值表达水平极显著上升(P0.01),HF+P组Cav1.2基因表达水平较HF组呈现极显著下降(P0.01),HF+N/LF+N 组 Cavl.2、CAMKⅡ、bcl-2、Bax 蛋白的表达水平极显著上升(P0.01),c-fos、Bax/bcl-2比值蛋白表达水平极显著下降(P0.01)。综上所述,氟暴露可降低细胞存活率,在一定暴露时间段内,使细胞内活性氧水平、细胞内钙离子水平、细胞凋亡水平上升,呈现一定的剂量依赖性,提示氟暴露可致细胞氧化应激增强;而L型钙离子通道激动剂FPL64176可在一定程度上加剧氟中毒,L型钙离子通道拮抗剂Nifedipine则可在一定程度上改善氟中毒致细胞损伤,Cav1.2蛋白表达水平呈现规律性变化,提示Cav1.2分子可能是氟中毒治疗中的重要分子靶点,L型钙离子通道抑制剂Nifedipine可能是氟中毒的有效治疗药物之一。
【图文】：

３实验结果逡逑３．邋１细胞活力检测结果逡逑细胞活力检测结果如图３．１。逡逑１邋ＩＣ￣逡逑２逦ｗｍｎ？逡逑１逦＿ｌｆ逡逑＾＾ＨＦ＋Ｐ逡逑＾＾ＨＦ＋Ｎ逡逑＇逦＾＾ＬＦ＋Ｐ逡逑ＦｈＴＨＩＬＦ－ｈＮ逡逑１１１１逡逑２ｈ逦４ｈ逦６ｈ逦８ｈ邋１０ｈ逦１２ｈ逦２４ｈ逡逑图３．邋１邋ｃｃｋ－８检测细胞存活率逡逑注：＞＜０．０５，邋￣Ｐ＜０．０１，与对照组（Ｃ）相比；逡逑＊Ｐ＜０．邋０５，邋＂Ｐ＜０．邋０１，ＨＦ＋Ｐ，ＨＦ＋Ｎ组与ＨＦ组相比；逡逑‘Ｐ＜０．邋０５，邋＊‘Ｐ＜０．邋０１，邋ＬＦ＋Ｐ，邋ＬＦ＋Ｎ组与ＬＦ组相比；逡逑与对照组相比，染氟２ｈ后，ＨＦ组细胞存活率极显著下降（Ｐ＜０．０１）；与ＨＦ逡逑组相比，染氟２ｈ后，ＨＦ＋Ｎ组细胞存活率显著上升（Ｐ＜０．０５）；与对照组相比，染氟逡逑４ｈ后，ＨＦ和ＬＦ组细胞存活率极显著下降（Ｐ＜０．０１）；与ＨＦ氟组相比，染氟４ｈ逡逑后，ＨＦ＋Ｎ组细胞存活率显著上升（Ｐ＜０．０５）；与ＬＦ组相比，染氟４ｈ后，ＬＦ＋Ｎ逡逑组细胞存活率显著上升（Ｐ＜0．0５）；与ＨＦ组相比

ＨＦ组细胞存活率极显著下降（Ｐ＜０．０１）。逡逑３．邋２细胞形态观察逡逑细胞形态观察结果如图３．２。逡逑Ｂ邋Ｃ邋Ｄ逡逑Ｅ逦：：逦．—邋Ｇ逦；＾ｍ逡逑图３．２邋细胞形态观察逡逑Ａ：对照组（Ｃｏｎｔｒｏｌ）逦Ｂ：ＨＦ邋组邋Ｇ：ＬＦ邋组逡逑Ｄ：ＨＦ＋Ｐ邋组（ＨＦ＋ＦＰＬ６４１７６）邋Ｅ：ＨＦ＋Ｎ邋组（ＨＦ＋Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）逡逑Ｆ：ＬＦ＋Ｐ邋组（ＬＦ＋ＦＰＬ６４１７６）邋Ｇ：ＬＦ＋Ｎ邋组（ＬＦ＋Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）逡逑由图２可见，对照组ＰＣ１２细胞呈长梭形，有２到多个突起，染氟２４ｈ后，逡逑ＨＦ组细胞的密度下降，有部分细胞开始变圆，凋亡细胞的数目变多，甚至有的逡逑可以看到明显的细胞碎片（图２Ｂ）和凋亡小泡；与ＨＦ组相比，，ＨＦ＋Ｎ组碉亡逡逑细胞数目明显变少。逡逑２３逡逑
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R599.1

【参考文献】

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本文编号：2691766