中枢胰岛素抵抗对神经元—星形胶质细胞间代谢偶联及神经元功能的影响

发布时间：2020-06-01 16:45

【摘要】：研究目的:近年来糖尿病发病率逐年增加,已成为严重威胁公众健康的疾病之一。糖尿病引起的中枢损伤即糖尿病相关性认知障碍也逐渐受到关注。胰岛素抵抗作为糖尿病的重要发病机制之一,参与了糖尿病相关并发症的发生发展。研究表明糖尿病相关性认知障碍的发生发展与中枢胰岛素抵抗关系密切。然而,现阶段中枢胰岛素抵抗对神经元形态与功能影响的相关研究较少,中枢胰岛素抵抗引起糖尿病相关性认知障碍的具体机制也尚不明确。生理情况下,神经元-星形胶质细胞间的代谢偶联对学习、认知及记忆形成等过程至关重要,但中枢胰岛素抵抗情况下神经元-星形胶质细胞间代谢偶联的变化尚不清楚。基于此,本研究拟建立神经元-星形胶质细胞共培养体系下的胰岛素抵抗模型,观察中枢胰岛素抵抗对神经元形态与功能的影响,并探讨神经元-星形胶质细胞间代谢偶联在中枢胰岛素抵抗引起神经元损伤中的作用;之后,我们选用可以改善胰岛素抵抗的降糖药物进行干预,观察降糖药物对上述神经元损伤及神经元-星形胶质细胞间代谢偶联的改善作用。研究方法:⑴采用改良的“三明治式”共培养方法建立神经元-星形胶质细胞共培养体系,以模拟机体中枢部位神经细胞微环境,比较共培养体系与非共培养体系下神经元形态及细胞活性差异;并利用胰岛素、葡萄糖、棕榈酸三种方法进行胰岛素抵抗模型的探索,通过MTT方法等观察三种造模方法对神经元的影响,寻找共培养体系下胰岛素抵抗的最佳方法;通过western blot检测胰岛素信号通路相关蛋白水平进行中枢胰岛素抵抗的验证与评价;⑵通过HE染色,尼氏染色等方法观察胰岛素抵抗对共培养体系下神经元形态学的影响;通过荧光及流式细胞术检测和评估神经元的凋亡情况;通过western blot方法检测神经元突触可塑性蛋白表达情况以评价突触功能;通过β半乳糖苷酶染色、端粒酶活性检测及衰老相关蛋白Sirt1蛋白表达情况评估神经元的衰老情况;⑶通过western blot方法检测神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关单羧酸转运体蛋白表达情况(MCT1,MCT2,MCT4);通过试剂盒检测培养基中、神经元细胞内及星型胶质细胞内相关能量代谢底物如乳酸、丙酮酸等变化;检测糖酵解相关关键酶的活性及蛋白表达情况;检测谷氨酸-谷氨酰胺循环中相关转运体的蛋白表达变化及谷氨酸浓度变化;⑷通过选取可以改善胰岛素抵抗的降糖药物进行干预,通过HE染色、尼氏染色观察神经元的形态变化;通过流式细胞术等方法检测降糖药物对神经元凋亡的改善作用;通过β半乳糖苷酶染色法以及衰老相关蛋白Sirt1蛋白表达情况评估降糖药物对神经元衰老的影响;通过western blot检测神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关转运体的蛋白表达变化;通过试剂盒检测神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关能量底物的变化;检测谷氨酸-谷氨酰胺循环中相关转运体及谷氨酸等浓度变化。研究结果:⑴利用改良的“三明治式”共培养方法建立神经元-星形胶质细胞共培养体系能够在最大程度上模拟机体中枢部位微环境,更有利于神经元生长,神经元形态更为健康,且共培养体系下神经元细胞活性更高;与葡萄糖、胰岛素相比,棕榈酸对神经元的杀伤作用更为明显;且0.1mM棕榈酸可以引起神经元发生胰岛素抵抗,表现为胰岛素信号通路相关蛋白表达下降,即PI3K表达下降,p IRS/IRS比值及pAkt/Akt比值下降;⑵中枢胰岛素抵抗可以使神经元形态发生明显改变,细胞突起数量减少、细胞间联系减少;突触可塑性相关蛋白表达下降,包括PSD95,Arc,synapsin1,pCREB/CREB,BDNF等蛋白表达下降;加速神经元凋亡情况;神经元衰老加速,包括β半乳糖苷酶染色阳性细胞增加,端粒酶活性下降,以及衰老相关蛋白Sirt1表达降低;⑶中枢胰岛素抵抗可以使神经元-星形胶质细胞间代谢偶联相关转运体表达下降,培养基中乳酸浓度下降;而神经元与星型胶质细胞内乳酸、丙酮酸浓度升高;与此同时神经元与星形胶质细胞内糖酵解相关酶即己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活性升高且蛋白表达增加;谷氨酸-谷氨酰胺循环相关转运体表达下降,谷氨酸浓度异常;⑷降糖药物可以明显改善胰岛素抵抗下神经元细胞形态、细胞凋亡、突触可塑性相关蛋白表达以及神经元衰老情况;降糖药物可以改善神经元-星形胶质细胞间代谢偶联,减轻神经元与星型胶质细胞内糖酵解情况并改善神经元与星形胶质细胞间谷氨酸-谷氨酰胺循环。研究结论:我们利用改良的“三明治式”共培养方法建立神经元-星形胶质细胞共培养体系,在给予棕榈酸刺激后建立了神经元-星形胶质细胞共培养体系下中枢胰岛素抵抗模型,可得到以下结论:⑴中枢胰岛素抵抗可以影响神经元的形态与突触可塑性,加速神经元凋亡与衰老的进程;⑵而神经元-星形胶质细胞间代谢偶联紊乱以及神经元内糖酵解的异常激活在中枢胰岛素抵抗加速神经元损伤与衰老过程中发挥重要作用;⑶降糖药物可明显改善中枢胰岛素抵抗引起的神经元形态与功能的损伤,改善神经元衰老进程,而降糖药物对神经元-星形胶质细胞间代谢偶联及糖酵解的改善作用在其中起到关键作用。
【图文】：

认知功能障碍,糖尿病,生物标志物,危险因素

图 2.1 糖尿病相关性认知功能障碍的危险因素及相关生物标志物[14]。Fig 2.1 Risk factors and biomarkers for diabetes-related cognitive decline[14].2.1.1.糖尿病相关性认知障碍血清学生物标志物现有关于血清中相关生物标志物与糖尿病相关性认知障碍的研究相对较多，提示糖尿病相关性认知障碍可能受外周或系统因素影响，并不完全局限于中枢部位改变。涉及到的血清中相关生物标志物大致可分为糖代谢相关指标、胰岛素抵抗相关指标及炎症因子三大类。⑴ 糖代谢相关指标在糖尿病进展过程中糖代谢紊乱是最为明显的临床表现，而血糖控制欠佳与糖尿病各种并发症的发生直接相关。Zhou 等[15]通过对 114 名糖尿病伴轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）患者及 83 名正常认知功能的糖尿病患者进行血清检测，，发现患者智力状态检查量表分数（mini-mental stateexamination, MMSE）与餐后 2 小时血糖(P<0.001)、空腹 C 肽水平(P=0.001)呈负

传导过程,信号通路,胰岛素

图 2.2 胰岛素信号通路传导过程[76]。Fig 2.2 The insulin signaling pathway[76].素抵抗（IR）[77]是指机体器官组织对胰岛素的生物学反应下降岛素敏感性下降（受体数目减少）或胰岛素反应性降低（受体结合胰岛素受体后途径异常，临床表现为高胰岛素血症。由于与 2 型糖管疾病的发生密切相关[78]，胰岛素抵抗来已成为近年的国际研究
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2

【参考文献】