VEGF-B信号通路在追赶生长过程中对骨骼肌脂质异位沉积的调节作用

发布时间：2020-06-14 04:55

【摘要】：第一部分VEGF-B信号通路在追赶生长小鼠骨骼肌中的变化及与骨骼肌脂质沉积的关系目的:1.探究VEGF-B信号通路在追赶生长小鼠骨骼肌中的变化情况。2.探究VEGF-B信号通路在追赶生长小鼠骨骼肌中脂质沉积中发挥的作用。方法:1.6周龄C57BL/6J小鼠共72只随机分为三组:(1)正常对照组(NC):正常普通饮食12周;(2)追赶生长组(RN):50%热卡限食4周后开放正常饮食8周;(3)追赶生长病毒干预组(RN+AAV9):骨骼肌局部病毒干预后追赶生长组。2.分别于限食4周末、开放饮食8周末对小鼠进行如下检测:(1)行糖耐量试验(IPGTT)与胰岛素耐量试验(IGITT)以评估小鼠机体胰岛素敏感性;(2)3HOA灌胃,评估小鼠骨骼肌局部脂质转运情况;(3)检测小鼠血清中血脂相关指标变化情况;(4)检测骨骼肌中脂质沉积情况;(5)检测骨骼肌中VEGF-B信号通路变化情况。结果:1.限食4周末,追赶生长小鼠骨骼肌中VEGF-B信号通路处于激活状态,骨骼肌局部胰岛素敏感性增加,骨骼肌对脂肪酸的摄取增加。2.开放饮食8周后,追赶生长小鼠骨骼肌中脂质沉积较对照组增加,VEGF-B信号通路处于持续激活状态,骨骼肌局部出现明显胰岛素抵抗,骨骼肌对脂肪酸的摄取明显增加。3.下调VEGF-B表达后,追赶生长小鼠在开放饮食8周末,骨骼肌局部脂质沉积减轻,胰岛素敏感性得到改善,骨骼肌对脂肪酸的摄取明显下降。结论:1.VEGF-B信号通路介导了追赶生长小鼠骨骼肌中脂质沉积。2.干扰VEGF-B信号通路可减轻追赶生长小鼠骨骼肌中脂肪酸的摄取及脂质沉积,改善追赶生长小鼠骨骼肌胰岛素敏感性。第二部分表观遗传修饰在追赶生长过程中对骨骼肌VEGF-B变化的调控作用目的:探究DNA甲基化修饰及组蛋白甲基化修饰在追赶生长过程中骨骼肌VEGF-B变化中发挥的作用。方法:1.在我们课题组前期已构建成功的追赶生长大鼠模型上,采用重亚硫酸盐处理测序(BSP)的方法,检测追赶生长大鼠(RN)及正常饮食大鼠(NC)胫骨前肌中Vegfb启动子区DNA甲基化的变化情况。2.采用实时定量PCR技术(q PCR)筛选可能调控组蛋白甲基化修饰的相关组蛋白甲基化酶,随后采用免疫印迹技术(Western Blotting)及染色质免疫共沉淀技术(CHIPq PCR)验证发生改变的甲基化酶或去甲基化酶是否参与了Vegfb的变化调控。3.体外培养L6成肌细胞,通过干扰或过表达相关去甲基化酶的表达,进一步确定去甲基化酶对VEGF-B表达的调控作用。结果:1.Vegfb启动子区DNA甲基化水平在正常组及追赶生长组中未发现明显异常。2.PHF2作为一种去甲基化酶,在限食末期及开放饮食8周末,均出现明显下降,其调控的Vegfb启动子区H3K9me1的表达量也相应地升高。3.细胞实验进一步验证发现,PHF2可通过调节Vegfb启动子区H3K9me1的水平来调控VEGF-B的表达。结论:在追赶生长过程中,去甲基化转移酶PHF2可通过调控H3K9me1来调节VEGF-B的表达。 【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1

【图文】：

示意图,实验小鼠,示意图,局部注射

12 小时照明与 12 小时黑暗交替进行。实验小鼠均给予单笼饲养，充足饮水，给予高压灭菌过的普通饲料喂养。专人负责实验小鼠的饲养，每日定时检测小鼠的体重、食物摄入量及生长状况，每 3-5 天补充饮用水并更换垫料。小鼠适应性喂养一周后随机分组以进行正式实验。2.1.2 实验小鼠的分组及造模方法小鼠适应性喂养一周后随机分为三组：（1）正常对照组（NC，24 只）：给予普通饲料正常饮食共 12 周；（2）追赶生长组（RN，24 只）：50%热卡限食 4 周，开放饮食8 周，共 12 周；（3）追赶生长+AAV 病毒局部干预组（RN+AAV9，24 只）：胫骨前肌一侧给予肌肉局部注射 AAV9 病毒局部干预 VEGF-B、对侧局部注射 AAV9-Control 病毒后再适应喂养一周，随后进行 50%热卡限食 4 周，开放饮食 8 周，共计 13 周。每个组均可分为两个亚组：限食 4 周末，可分为 NC4、R4、R4+AAV9 组；开放饮食 8周末，可分为 NC12、RN8、RN8+AAV9 组。

胫骨前肌,病毒感染,小鼠,情况

华中科技大学博士学位论文组相比，P < 0.01。2 AAV9 病毒注射后肌肉感染情况评估100 倍荧光显微镜下可见，小鼠胫骨前肌注射 4W 及 12W 后，，AAV9 均能明显感染骨骼肌组织（图 2）。相应地，与正常组小鼠（NC）相比，注射 AAV9-shVegfb 后的小鼠 VEGF-B 的 mRNA 及蛋白表达水平明显下降（P < 0.05，图 3A 及 3B），在第 12周，注射干扰病毒小鼠 VEGF-B 的表达下降得更为明显（P < 0.01，图 3A 及 3B）。

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