MKP-5在糖脂混合毒性诱导小鼠胰岛β细胞凋亡及功能障碍中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-27 04:32

【摘要】：糖尿病是由环境与遗传两个主要因素长期共同作用引起的胰岛素分泌相对不足或胰岛素抵抗,并以持续性高血糖为特征性表现的自身代谢性疾病。主要包括I型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)与II型糖尿病(Type 2 diabetes mel itus,T2DM),其中T2DM占糖尿病发病率的90%以上。T2DM患者体内糖代谢异常与脂代谢异常是并存的,并且糖毒性与脂毒性在T2DM的发生发展中并非孤立起作用,两者之间相互协同。研究表明,高血糖能够促进FFA诱导胰岛β细胞的凋亡。FFA能通过抑制胰岛素分泌,降低葡萄糖利度等多种机制进一步增加血液中葡萄糖浓度,加重高血糖程度,从而构成糖脂混合毒性(glucolipotoxicity,GP)。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)广泛分布于各种动物体内,在细胞生长、发育、死亡等一系列生理活动中发挥重要作用,是调控生命活动重要的信号转导系统之一,在T2DM信号通路中充当重要角色。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen-activated protein kinase phosphatases,MPKs)又称双特异性磷酸酶,能够通过去磷酸化使MAPKs失活,这种负向调控调节作用,在细胞的应激、增殖、分化、凋亡等活动中发挥重要作用,其异常表达与糖尿病的发生、发展密切相关。MKP5是MKP家族成员之一,已有研究表明其在机体代谢及T2DM中发挥调节作用。然而,MKP5在GP诱导胰岛β细胞凋亡以及功能障碍中具体机制仍有待探明。本实验通过构建MKP5过表达小鼠MIN6细胞系,探讨MKP5在GP诱导小鼠胰岛β细胞凋亡、功能障碍中的作用及其潜在分子机制。实验目的:探讨MKP5在糖脂毒性诱导MIN6细胞凋亡、功能障碍中的作用及其潜在的分子机制。实验方法:(1)MKP5过表达稳定细胞系构建与鉴定:取本实验已构建成功的pcDNA3.1-MKP5质粒与pcDNA3.1空质粒对MIN6细胞进行转染。构建MKP5基因过表达的MIN6稳定细胞系(MIN6-MKP5)以及对照组细胞系(MIN6-PC),使用Western Blot法对转染后的MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞中MKP-5蛋白表达情况进行检验。(2)细胞增殖检测:糖脂毒性(33.3mM葡萄糖、0.4Mm PA)作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞24h后,使用CCK-8试剂检测MKP-5基因对MIN6细胞增殖的影响。(3)细胞凋亡分析:A.糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞24h后,使用Hoechst 33258染色法初步分析MKP-5基因在糖脂毒性诱导MIN6细胞凋亡中的影响。B.AnnexinV-FICT/PI双染法结合流式细胞仪分析糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞18h后的凋亡率。(4)Realtime PCR检测相关基因水平变化:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞12h后,采用Realtime PCR检测与凋亡(Bcl-2、Bax)、功能(PDX-1)、氧化应激(NOX4、p22phox)相关的基因水平变化。(5)Western Blot法检测相关蛋白水平变化:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞0、24h后,采用Western Blot法检测与凋亡(Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9)、功能(GLUT2)相关的蛋白表达水平变化。(6)细胞活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平检测:使用DCFH-DA荧光探针结合荧光酶标仪分析糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞24h后的ROS水平。(7)MAPK信号通路磷酸化水平检测:糖脂毒性作用MIN6-PC、MIN6-MKP5两种细胞0、1、3、6、9、12h后,采用Western Blot法检测P38、ERK、JNK三种信号通路蛋白磷酸化水平的变化。实验结果:(1)Western结果表明,与MIN6-PC组细胞相比,MIN6-MKP5组细胞中MKP-5蛋白表达明显升高。实验结果表明,MKP-5过表达MIN6细胞系构建成功。(2)CCK-8结果显示,MIN6-PC组细胞活力下降20%,具有统计学意义(P0.05)。MIN6-MKP5糖脂协同处理组细胞活力为(73.27±2.33)%,较MIN6-PC糖脂协同处理组细胞(42.70±2.47)%,明显升高。MIN6-MKP5乙醇对照组细胞活力较MIN6-PC乙醇对照组细胞活力升高40%(P0.05),该实验表明MPK-5能够缓解高糖高脂对胰岛β细胞增殖抑制的作用。(3)细胞凋亡分析结果:A.Hoechst结果表明:MPK-5可能在糖脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡过程中发挥一定作用。B.Annexin-V-FICT/PI试剂与流式细胞仪检测细胞凋亡,结果表明:MIN6-MKP5糖脂处理组细胞凋亡率明显低于MIN6-PC糖脂处理组细胞凋亡率。此结果与Hoechst 33258染色法检测MIN6细胞凋亡结果基本一致。(4)Realtime PCR结果显示:MIN6-PC糖脂处理组Bcl-2与Bax比值较其乙醇对照组降低47%,与MIN6-MKP5糖脂处理组相比降低显著(P0.05);MIN6-MKP5组细胞NOX4、p22phox基因mRNA的表达均显著低于MIN6-PC组细胞(P0.05)。实验结果表明,MKP-5能够有效抑制ROS相关基因NOX4与p22phox的表达;Western Blot结果显示,MIN6-MKP5组细胞Caspase-3蛋白表达量始终处于较低水平;MIN6-PC糖脂处理组细胞PDX-1基因mRNA的表达明显低于MIN6-MKP5糖脂处理组(P0.05)。(5)Western Blot结果显示,与其自身空白对照组相比,MIN6-PC组细胞与MIN6-MKP5组细胞Caspase-3与Caspase-9的活化水平均明显升高。MIN6-MKP5组细胞Caspase-3与Caspase-9蛋白活化水平均显著低于MIN6-PC组细胞。MIN6-PC组细胞与MIN6-MKP5组细胞糖脂处理组GLUT2蛋白表达量均明显下降,但MIN6-MKP5组细胞空白对照组与糖脂处理组GLUT2蛋白表达量均高于MIN6-PC组细胞;(6)ROS结果表明,MIN6-MKP5糖脂处理组细胞与其乙醇对照组相比,升高并不明显。而MIN6-PC糖脂处理组细胞内ROS水平升高显著,是其乙醇对照组的近2倍(P0.05)。MIN6-MKP5糖脂处理组细胞ROS水平升高明显低于MIN6-PC糖脂处理组(P0.05)。实验结果表明,MKP-5能够有效抑制由糖脂毒性诱导的胰岛β细胞内ROS水平的增加。(7)Western Blot检测MAPK信号通路磷酸化水平,结果表明MKP-5基因具有抑制P38、JNK蛋白活化的作用;与P38蛋白与JNK蛋白不同的是,随着糖脂协同处理过程中,MIN6-PC与MIN6-MKP5两种细胞的ERK蛋白活化水平并无显著差异,表明MKP-5在MIN6细胞中,对MAPK家族中JNK、P38通路下调作用明显,对ERK通路的调节作用不显著。实验结论:(1)MKP-5通过下调p38、JNK通路参与调控糖脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡及功能障碍;(2)MKP-5可能通过线粒体途径缓解糖脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡及功能障碍。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1
【图文】：

柱形图,细胞系,稳定表达,柱形图

4.1 稳定表达 MKP-5 细胞系的鉴定使用 Western Blot 法对转染后的 MIN6-PC、MIN6-MKP5 两种细胞中 MKP-5蛋白表达情况进行检验。结果显示（图4.1），与MIN6-PC组细胞相比，MIN6-MKP5组细胞中 MKP-5 蛋白表达明显升高。实验结果表明，MKP-5 过表达 MIN6 细胞系构建成功。图 4.1 稳定表达 MKP-5 基因细胞系 MIN6-MKP5 的鉴定A.Western Blot 检测 MIN-PC、MIN-MKP5 细胞系中 MKP-5 蛋白的表达B.重复实验结果柱形图统计分析 *P<0.05, MIN-PC vs MIN-MKP54.2 MKP-5 在糖脂毒性刺激 MIN6 细胞增殖中的影响为了分析 MKP-5 在糖脂协同刺激 MIN6 细胞增殖中的作用，采用 CCK-8 检测细胞活力（图 4.2），结果显示，糖脂协同刺激（33.3mM 葡萄糖与 0.4mM PA，用 GP 表示）MIN6-PC、MIN6-MKP5 两组细胞 24h后，MIN6-PC GP 组细胞活

细胞活力,毒性抑制,糖脂,乙醇

第 4 章实验结果其乙醇对照组下降 20%，具有统计学意义（P<0.05）。MIN6-MKP5 GP 处细胞活力为（73.27±2.33）%，较MIN6-PC GP处理组细胞活力（42.70±2.47）%升高。此外，MIN6-MKP5 乙醇对照组细胞活力较 MIN6-PC 乙醇对照组力升高 40%（P<0.05），该实验表明 MPK-5 能够缓解高糖高脂对胰岛 β 细增殖抑制作用。

【参考文献】