NETs形成与桥本氏甲状腺炎发病的关系及其相关机制研究

发布时间：2020-07-14 05:06

【摘要】：背景桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis,HT)为临床中最常见的甲状腺炎症。随着生活节奏的加快,桥本氏甲状腺炎的发病率逐年升高。桥本氏甲状腺炎发展缓慢,病情可反复交替为甲状腺功能亢进和减退,或导致甲状腺结节、甲状腺肿,特别是甲状腺功能减退引发的全身乏力、腹胀、少尿、动作迟缓、表情淡漠等自觉症状及甲减性心脏病、血脂代谢异常、粘液性水肿等并发症,在严重时可造成全身多脏器功能损害,不但对患者的身体健康造成极大的伤害,更给患者的正常生活和工作造成极大的影响。因此,努力提高桥本氏甲状腺炎的预防、诊断和治疗水平至关重要。免疫损伤、遗传易感性和环境因素中的高碘摄入及病毒感染可能相互作用参与了本病发生,但具体机制仍不明确。对本病病因和病理机制的研究仍处于初级阶段,特别是在分子生物学领域还有很大的探索空间。中性粒细胞作为人体固有免疫系统的哨兵,在血液的非特异性细胞免疫系统中起着十分重要的作用,通过分泌细胞因子、脱颗粒、吞噬作用、呼吸爆发等机制杀灭并清除病原体。除上述机制外,Zychlinsky实验室于2004年报道了在PMA存在情况下,中性粒细胞能够被诱导活化并释放出包裹着组蛋白、弹性蛋白酶、抗菌蛋白等多种胞内物质的网状DNA纤维结构,可以在感染部位对病原菌进行包裹、限制及杀伤,并将这一新发现的中性粒细胞抗菌及防御反应结构命名为中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)。近来研究表明,系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、脉管炎、1型糖尿病等免疫性疾病患者来源的中性粒细胞在体外更易被诱导活化生成NETs,同时来自患者的血清也可以促进NETs产生,提示以NETs形式引发的细胞内成分外露已成为机体自身抗原的可能来源,而NETs在释放、清除缺陷及随后反应过程的调节失衡则参与了多种自身免疫性疾病的发病和进展。然而,NETs在HT患者体外的表达及其可能的相关机制此前尚未见报道。目的1.观察中性粒细胞体外诱导活化在HT患者和健康对照人群中的差异;2.初步阐明在NETs形成过程中可能涉及的分子机制及信号通路;3.研究NETs中可能含有的自身抗原,初步揭示HT患者来源的NETs与该病发病的可能相关性。方法1.病例选择收集2015年10月至2016年12月山东大学第二医院门诊及住院桥本甲状腺炎女性患者30例,患者均需行甲状腺B超、甲状腺功能及自身抗体检查。诊断标准参照《中国甲状腺疾病诊治指南》(中华医学会内分泌学会,2008年)。入选标准为:①弥漫性甲状腺肿大,质地较韧,特别是伴颊部椎体叶肿大者;②甲状腺抗过氧化物酶抗体(TPOAb)和(或)甲状腺球蛋白抗体(TGAb)阳性者;③甲状腺细针穿刺细胞学检查(FNAC)示甲状腺弥漫性淋巴细胞及浆细胞浸润、纤维化;④甲状腺功能检查示TSH上升,伴或不伴有FT3和(或)FT4下降;⑤满足上述标准的患者签署临床研究知情同意书后入选该研究。其中①②④⑤是必备条件。排除标准为:(1)发热、妊娠或哺乳期妇女;(2)严重心、脑、肝、肾等重要脏器功能障碍;(3)合并其他自身免疫疾病;(4)甲状腺癌、单纯性甲状腺肿者及其他原因引起的甲状腺功能异常者;(5)恶性疾病:肿瘤;(6)贫血;(7)急、慢性炎症疾病。对照组均来自医院年龄匹配的同性别健康体检者,无甲状腺家族史,无系统性疾病史,血常规、尿常规、肝功、肾功、血脂、甲状腺功能正常。2.血液样本收集与保存入选患者清晨抽取空腹外周血15ml,其中10ml置于0.25%EDTA抗凝管中用于中性粒细胞分离提取及留取血浆(各5ml),另外5ml置于促凝管中用于制备血清样本。收集全血在2小时内分离提取纯度及活性高的中性粒细胞并进行后续诱导活化实验。血清及血浆样本经离心获取,冻于-80℃备用。3.建立体外PMA诱导NETs形成体系明确PMA诱导中性粒细胞活化的最佳浓度及时间点,将PMA作用时间及浓度梯度分组,荧光半定量NETs形成,对NETs中含有的特异性蛋白H3Cit进行鉴定,确定NETs产物。4.定量分析不同来源的中性粒细胞NETs生成差异采取免疫荧光半定量和流氏细胞术定量的两种方法对HT患者组和健康对照组的中性粒细胞于体外活化后的NETs产物进行分析,明确两组NETs产物在数量上是否存在差异。5.诱导活化前后炎症因子变化对HT患者组和健康对照组中性粒细胞进行体外PMA诱导活化,观察不同来源的中性粒细胞NETosis前后培养上清液中炎症因子IL-6的变化。6.筛选NETs形成过程中可能涉及的分子机制及信号通路对不同来源的中性粒细胞进行体外PMA诱导活化,观察中性粒细胞胞内ROS、NADPH氧化酶、线粒体超氧化、Ca2+、PAD4等水平变化并筛选可能信号通路。7.统计学分析所有试验数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析。数值变量的描述统计采用均数±标准误表示,分类变量的统计描述采用频率或者百分率表示。两组间均数比较使用Student t检验。P0.05即为存在统计学意义。结果1.入选病例的基本情况30例女性患者符合入选标准,年龄在25-57岁,平均年龄35岁,同时选取年龄匹配的30例健康女性作为对照组,获得其相关全部资料。所有患者均接受甲状腺B超、血常规、甲状腺功能及自身抗体检查。2.体外PMA诱导NETs形成体系建立PMA诱导NETs形成的最佳刺激浓度和时间分别为25 nM和1 h,在此条件下诱导中性粒细胞的中位活化率为28.2%。通过SYTOX orange/DAPI双染色进一步观察中性粒细胞NETs形成情况。以获得的最佳浓度及刺激时间点活化健康人来源的中性粒细胞,对NETs中含有的特异性瓜氨酸化组蛋白H3Cit进行免疫荧光检测,并对NETs中的染色质及核酸成分进行测定,进一步证实NETs形成。3.不同来源的中性粒细胞NETs生成量差异基于流式细胞学技术对NETs生成进行定量分析结果为HT来源的中性粒细胞诱导中位活化率为80.7%,而健康对照组来源的中性粒细胞诱导中位活化率为66.1%;采取免疫荧光半定量技术对NETs生成进行定量分析结果为HT来源的中性粒细胞诱导中位活化率为52.5%,而健康对照组来源的中性粒细胞诱导中位活化率为26.8%。两种方法获得的生成量差异均存在显著统计学意义(P0.001)。4.PMA诱导活化前后组间炎症因子IL-6的变化HT患者及健康对照组来源的中性粒细胞在加入PMA诱导活化及空白对照的条件下分别观察1h、4 h。统计分析发现,PMA诱导活化条件下,细胞培养1 h,HT患者组细胞上清液中的IL-6水平为105.6±27.8pg/mL,而健康对照组细胞上清液中的IL-6水平为65.9±12.1pg/mL,差别具有统计学意义(P0.01);细胞培养4 h,HT患者组细胞上清液中的IL-6水平为254±32.1 pg/mL,而健康对照组细胞上清液中的IL-6水平为159.4±25.3 pg/mL,差别具有统计学意义(P0.001)。在空白对照条件下,细胞培养1 h,HT患者组细胞上清液中的IL-6水平为8.5±0.9 pg/mL,而健康对照组细胞上清液中的IL-6水平为7.9±1.1 pg/mL,两者无明显统计学差异;细胞培养4 h,HT患者组细胞上清液中的IL-6水平为62.9±11.5pg/mL,而健康对照组细胞上清液中的IL-6水平为14.2±6.1pg/mL,差别具有统计学意义(P0.001)。5.筛选NETs形成过程中可能涉及的分子机制及信号通路的组间比较在ROS及NADPH氧化酶水平研究显示,在引入ROS清除剂NAC后,HT患者来源的NETs形成率较对照组发生了更大幅度的下降(P0.001);同样的,在引入NADPH氧化酶抑制剂DPI后,HT患者来源的NETs形成率较对照组也发生了更大幅度的下降(P0.001);在线粒体超氧化水平的研究结果显示实验开始后至60 min的观察时间内,HT患者组的线粒体超氧化的水平显著高于同期对照组水平(P0.001),而随着观察时间继续延长,至120min观察点时,HT患者组和对照组的线粒体超氧化的水平却出现了明显下降,即便如此,HT患者组的线粒体超氧化的水平仍高于同期对照组水平(P0.001);随后,通过引入细胞外Ca2+螯合剂EGTA、细胞内Ca2+螯合剂BAPTA、细胞内钙动员拮抗剂TMB-8等三种外源性钙阻断剂,结果显示不论HT患者组还是健康对照组,在PMA存在的情况下,NETs生成率均发生了较大幅度的下降(P0.001),且HT患者组NETosis下降幅度明显高于健康对照组(BAPTA,P0.01;TMB-8,P0.05);在PAD4分子水平的研究结果显示PMA诱导不同来源的中性粒细胞NETs形成后,不论HT患者组还是健康对照组,在引入PAD4阻断剂Cl-amidine后,对NETs形成率均无明显抑制作用(P0.05)。6.研究NETs中可能含有的自身抗原采用HT患者及对照者血清作为细胞免疫荧光技术的一抗,基于抗原-抗体反应原理,与PMA诱导的NETs成分进行免疫反应。结果表明,HT患者来源的NETs仅可以与HT患者血清一抗发生抗原抗体结合反应在荧光显微镜下发出耀眼的绿色荧光,而与健康对照者血清作用后不能呈现耀眼的绿色荧光。上述研究表明HT患者来源的NETs中含有自身抗原成分。结论1.在体外HT来源的中性粒细胞较健康对照组更易被活化诱导产生NETs,同时伴有培养上清液中IL-6水平的升高。2.PMA诱导NETs形成需要ROS、NADPH氧化酶、线粒体超氧化、Ca2+等分子或信号参与,而HT患者NETs形成则更加依赖上述分子或信号的参与作用;PAD4在PMA诱导的NETs形成中作用不显著。3.初步揭示了 HT患者来源的NETs中含有自身抗原,可与HT血清发生抗原抗体反应。背景桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT),是一种以自身甲状腺组织为抗原的慢性自身免疫性疾病,通常伴有多种针对甲状腺自身抗体水平的升高。近年来,随着人们对于中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)结构和功能研究的深入,也逐渐揭开了其作为机体自身免疫反应的重要环节发挥着可能致病的作用。在中性粒细胞产生NETs的NETosis过程中引起大量中性粒细胞胞内成分以蛋白-核酸混合的网状形式释放至细胞外基质,其中已经证实的主要成分有中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及丝氨酸蛋白酶3(proteinase 3,PR3)。近年来研究发现NETs在释放、清除缺陷及随后反应过程的调节失衡参与了某些自身免疫性疾病的发病和进展,NETs相关产物如NE、MPO、PR3等在相关疾病中的含量明显升高,提示NETs产生可能与自身免疫性疾病的发病环节相关联。然而,NETs在HT患者中血液中的表达及其与甲状腺主要自身抗体的关系尚无研究。目的1.比较HT患者和健康对照者血浆NE、PR3水平;2.探讨循环中NE、PR3水平与TPOAb、TGAb等甲状腺抗体的关系及对疾病的预测价值,评估其是否可以作为HT疾病诊断的补充指标。方法1.病例选择(与论文I一致)收集2015年10月至2016年12月山东大学第二医院门诊及住院桥本甲状腺炎女性患者30例,患者均需行甲状腺B超、甲状腺功能及自身抗体检查。诊断标准参照《中国甲状腺疾病诊治指南》(中华医学会内分泌学会,2008年)。2.血清主要甲状腺功能和TGAb、TPOAb检测使用美国Beckman公司生产的UniCel DxI 800分析仪并采用化学发光免疫分析法检测每位受试者的甲状腺功能FT3、FT4、TSH及血清TPOAb和TGAb的水平。TPOAb和TGAb的检测阈值分别为0.25 IU/mL和0.37 IU/mL。3.血细胞主要成分的检测使用美国Beckman公司生产的UniCel DxH 800分析仪对受试者血细胞主要成分白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及红细胞、血小板数目进行分析。4.循环中NE、PR3的检测入选患者清晨抽取空腹外周血5ml,EDTA抗凝处理后分离血浆,采用ELISA方法对HT患者血浆中的NE、PR3浓度进行检测。5.分析NE、PR3水平与TPOAb、TGAb等甲状腺抗体的相关关系及对疾病的预测价值采用皮尔森相关系数r评估血浆NE、PR3水平与TPOAb、TGAb等主要甲状腺抗体的相关关系;对具有强相关关系的指标进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析。6.统计学分析数值变量资料以均数±标准误表示。两样本间的比较采用独立样本t检验。P0.05认为有统计学意义。结果1.入选病例的基本情况(与论文Ⅰ 一致)30例女性患者符合入选标准,年龄在25-57岁,平均年龄35岁,同时选取年龄匹配的30例健康女性作为对照组,获得其相关全部资料。2.血清主要甲状腺功能和TGAb、TPOAb检测HT患者血清FT4水平较健康对照者降低(P0.001),FT3水平相比较两组无明显统计学差异(P0.05);HT患者血清TSH中位数为7.84 μIU/mL,健康对照者TSH中位数为2.24μIU/mL,两组比较存在显著统计学差异(P0.001);血清TPOAb阳性率为90%,血清TGAb阳性率为76.6%,TPOAb、TGAb双阳性患者占总观察人群的66.7%。3.血细胞主要成分的检测HT患者和对照组血细胞在白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及红细胞、血小板数目上相比,无明显统计学差异(P0.05)。4.循环中NE、PR3的检测HT患者血浆中NE的中位表达水平是273.86 ng/mL,较健康对照组明显升高,两组差别具有统计学意义(P0.001);HT患者血浆中PR3的中位表达水平是74.99ng/mL,同样较健康对照组升高,两组差别具有统计学意义(P0.01)。5.循环中NE、PR3与TPOAb、TGAb等甲状腺抗体水平的相关关系对疾病的预测价值循环中PR3水平和TGAb之间有很强的正相关性(r = 0.3924,P=0.0319),同样,PR3水平也与TPOAb呈正相关性(r = 0.5098,P= 0.0040)。然而,循环中 NE 水平和 TGAb(r = 0.2674,P=0.1531)、TPOAb(r = 0.0294,P=0.8773之间均没有观察到显着的相关性。随后对PR3进行ROC曲线分析,AUC为0.792(P0.001),该指标预测HT的敏感性与特异性分别为66.7%和80.0%,约登指数分析切点为66.5 ng/mL。结论1.HT患者循环中NETs相关产物NE、PR3显著高于健康对照者;2.循环中PR3水平和TGAb、TPOAb呈现较强的正相关性,预测HT的敏感性与特异性分别为66.7%和80.0%,约登指数分析切点为66.5 ng/mL,PR3有望成为HT疾病诊断的新的生物标志物。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R581.4
【图文】：

时间梯度,形成率,标尺

图２Ａ邋ＰＭＡ诱导ＮＥＴｓ形成时间点（标尺：１００邋｜ｊｍ）逡逑１００％逦＊＊＊逡逑

时间梯度,形成率,标尺

图２Ｂ邋ＰＭＡ诱导ＮＥＴｓ时间梯度形成率逡逑

浓度梯度,标尺,形成率,生成率

ｌｉＩＩＩ逡逑０邋２５ｎＭ邋５０ｎＭ邋７５ｎＭ邋ｌＯＯｎＭ邋１５０ｎＭ逡逑图３Ｂ邋ＰＭＡ诱导ＮＥＴｓ浓度梯度形成率逡逑ＰＭＡ邋（２５、５０、７５、１００、１５０ｎＭ）分别诱导下２ｈ的ＮＥＴｓ生成率分别为逡逑４６．５％、４８．２％、５４．５％、８４．９％、８７．６％。＊＞＜０．０１，…尸＜０．００１，与空白对照组比逡逑较。逡逑４１逡逑

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