sCD163及相关因子在哮喘炎症表型中的作用及意义的研究

发布时间：2020-07-15 09:24

【摘要】：支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症性疾病,由多种炎症细胞、组织结构细胞及其细胞组分共同参与,表现为可逆的气流受限及气道高反应(AHR)。哮喘是最常见的慢性呼吸道疾病之一,在全球范围内发病率逐年增加。中国拥有众多的哮喘患者,给家庭和社会带来沉重的负担。如何预防、控制哮喘发作成为呼吸系统疾病救治的一项重要的临床课题。哮喘具有异质性,近年来的研究根据哮喘发病的年龄、诱因、呼吸道炎症、临床症状等分为不同的表型,不同表型对于治疗的反应性存在差异,所以,通过有效的分型方法确定哮喘分型,并给予有效的治疗方案十分必要。诱导痰所获得的下呼吸道痰液标本可反映气道炎症类型和炎症介质水平,从而评价药物治疗的效果。其具有安全、无创、可重复性的优点,对于评估哮喘下呼吸炎症细胞种类具有一定的优势。根据诱导痰中炎症细胞的分类和比例可将哮喘分为嗜酸粒细胞增多型哮喘(EA),中性粒细胞增多型哮喘(NA),粒细胞缺乏型哮喘(PA)及混合细胞型哮喘(MA)。研究表明嗜酸性粒细胞型哮喘患者对于糖皮质激素治疗较另外3型哮喘更为敏感。因此区分哮喘患者不同的炎症表型并据此选择适宜的治疗方案,对哮喘患者的控制发作、生活质量的改善等方面具有重要的意义。但是国内外研究发现不同地域哮喘的炎症表型分布结构不同,因此明确本地区哮喘的炎症表型、炎症因子表达特点对于指导本地区哮喘患者的诊治具有重要意义。目前大部分有关哮喘炎症细胞的研究多聚焦在嗜酸性粒细胞及其相关因子,对于肺泡巨细胞和外周血单核细胞在哮喘中的作用研究甚少。肺泡巨噬细胞是下呼吸道主要炎症细胞之一,也是诱导痰细胞分类中的重要细胞,在PA以及EA型哮喘中为优势细胞。巨噬细胞主要分为M1巨噬细胞(经典活化巨噬细胞)和M2巨噬细胞(替代活化巨噬细胞)。M1型巨噬细胞,通过分泌促炎因子和趋化因子,发挥免疫监视的功能。而M2型巨噬细胞,仅有较弱抗原提呈能力,在免疫调节中发挥重要作用,在哮喘中具有组织重建和恢复肺组织微环境平衡的作用。如果能增强M2型巨噬细胞的抗炎作用,有可能改善哮喘患者的气道重塑及对药物治疗的敏感性。因此,我们的研究意在探索巨噬细胞在哮喘中的作用机制及临床意义,为哮喘的个体化诊断、为靶向治疗哮喘药物的开发提供科学依据。CD163是M2型巨噬细胞的活化标志,是一种跨膜蛋白,仅表达于巨噬细胞/单核细胞系表面,被认为是清道夫受体之一,主要参与吞噬血红蛋白和血红蛋白-结合珠蛋白混合物,但随着深入的研究发现,从巨噬细胞表面释放的可溶性CD163(sCD163)参与多种疾病过程,如自身免疫疾病、肿瘤等。有研究显示sCD163与COPD患者的FEV1%预计值均呈负相关。哮喘患者肺泡中CD163+巨噬细胞降低,而痰中sCD163水平则升高,因此我们推测CD163+M2巨噬细胞及sCD163可能参与并影响哮喘患者气道的炎症反应。基于上述研究背景,我们以收集的稳定期哮喘患者及同期健康对照志愿者诱导痰及血清、外周抗凝血以及THP-1细胞系为研究对象,探讨长春地区哮喘患者炎症表型的临床特点,研究sCD163及相关炎症因子在不同哮喘炎症表型中的临床意义,探索sCD163与M2巨噬细胞在哮喘炎症亚型中的角色,为进一步研究本地区哮喘患者治疗个体化奠定理论基础。第1节:长春地区稳定期哮喘炎症表型及重症哮喘临床特点1.研究方法:从2013年11月到2015年8月随机收集在吉林大学白求恩第二附属医院呼吸内科住院或门诊就诊的符合入选标准的稳定期哮喘患者同期健康体检的对照人群,采取横断面研究的方法,同时收集参与者诱导痰、血清、外周抗凝血、肺功能参数(FEV1、FVC、FEV1/预计值、FeNO等),并对哮喘患者进行ACQ、ACT、AQLQ、焦虑抑郁评分等评估。对诱导痰进行处理,制作单层细胞涂片,依据痰标本中嗜酸粒细胞比例和中性粒细胞比例对哮喘患者进行炎症细胞分型。2.主要结果:(1)最终有132名哮喘患者及21名健康志愿者参与并完成此研究。哮喘组病人FEV1、FEV1/FVC、FEV1%预计值均较对照组明显降低(P0.001)。(2)哮喘组诱导痰中总细胞数(TCC)、嗜酸性粒细胞计数及比例、中性粒细胞计数及比例明显高于健康对照组(P0.05)。哮喘组外周血嗜酸性粒细胞计数与诱导痰嗜酸性粒细胞计数(r=0.347,P=0.002)、巨噬细胞计数(r=0.435,P0.001)呈正相关。哮喘患者FeNO与血嗜酸性粒细胞计数呈正相关(r=0.288,P=0.012),与诱导痰嗜酸性粒细胞计数呈正相关性(r=0.216,P=0.005)。(3)依据痰诱导炎症细胞分型如下:EA(60例,45.5%),PA(63例,47.7%),MA(4例,3.0%),NA(5例,3.8%)。MA组FEV1、FVC,FVC%预计值和FEV1%预计值均低于其他3组,差异具有统计学意义(P0.05)。FeNO(ppd)在EA组:47.1(31.7,114.5)最高,其次是MA组:35.5(21.1,69.5),NA组:30.2(15.3,55.9)最低。结果显示了本地区哮喘以PA型为主,各表型之间肺功能参数明显不同。(4)PA组上呼吸道感染诱发哮喘急性发作的患者比例高(77.8%,P0.05)。而且与EA组患者相比,PA组患者需要更高剂量的糖皮质激素及更多的联合用药方可控制哮喘(P0.05)。提示不同哮喘亚型哮喘急性的诱因及对治疗的反应性不同。(5)132名患者依据重症哮喘定义被分为重症哮喘组(32人,24.2%),和非重症哮喘组(100人,75.8%)。两组间患者的肺功能(FEV1,FVC,FEV1/FVC)以及健康状态评分(ACQ、ACT、AQLQ和焦虑抑郁评分)存在统计学差异(P0.05),说明重症哮喘组患者肺功能及健康状态评分均较差。(6)与非重症哮喘组相比,重症哮喘组的患者合并持续性咳嗽者比例(62.5%)明显升高(P0.05),控制哮喘所使用吸入糖皮质激素量也明显升高(P0.05)。提示重症哮喘患者气道炎症持续存在,需要更大剂量ICS控制气道炎症。(7)重症哮喘组的患者过去1年内住院次数、门诊就诊次数、急诊就诊次数、入住ICU次数以及需要全身应用糖皮质激素治疗次数较非重症哮喘组病人明显升高(P0.05)。说明重症哮喘患者急性发作次数更多及发作程度更重。3.结论:(1)哮喘患者气道各型炎症细胞计数明显高于正常人群。哮喘患者痰嗜酸性粒细胞计数、巨噬细胞计数与外周血嗜酸性粒细胞计数相关。(2)长春地区稳定期哮喘患者以PA及EA表型多见,其中PA患者最多。哮喘各炎症细胞表型临床特点:MA型患者肺功能最差,EA型气道反应性最高,PA组由呼吸道感染诱发哮喘急性发作的最多见,且需要更高剂量ICS治疗。通过了解和分析这些差异为研究不同类型哮喘的发病机制、为哮喘的个体化治疗奠定了一定基础。(3)与非重症哮喘患者相比,重症哮喘患者的生活质量、健康评分及肺功能都显著降低,合并症更多,哮喘控制的情况更差。因此临床工作中应注意此类患者的鉴别,给予更多的治疗指导,应注意非重症哮喘患者病情加重、向重症哮喘转化,加强哮喘患者管理。第2节:sCD163及相关因子在稳定期哮喘炎症表型中的表达及临床意义1.实验方法:ELISA方法检测所收集哮喘组及对照组诱导痰上清液及血清中各类炎症介质(IL-4,IL-5,IL-1β,IL-8,IL-9,IL-6,及sCD163)的水平。2.主要结果:(1)哮喘组参与者诱导痰上清液中的sCD163水平(pg/ml):26.42(13.64,40.37)明显高于正常对照组:13.64(12.44,21.1)(P0.001)。哮喘组和正常对照组的诱导痰上清液中sCD163的水平均高于其血清水平(P0.001)。提示诱导痰及血清中炎症介质功能及意义不同,我们推测sCD163可能主要反应哮喘患者气道内局部炎症。(2)哮喘患者诱导痰上清液sCD163与诱导痰上清液IL-9(r=0.339,P=0.030)和IL-5(r=0.692,P=0.001)水平呈正相关,与血清IL-6(r=-0.871,P=0.024)呈负相关;血清sCD16与诱导痰上清IL-9水平(r=-0.493,P=0.032)呈负相关。(3)哮喘患者诱导痰上清液中sCD163水平与外周血嗜酸粒细胞计数(r=-0.293,P=0.031)及与诱导痰嗜酸性粒细胞计数(r=-0.319,P=0.027)呈负相关。提示了诱导痰上清液sCD163水平可能一定程度上反应哮喘患者嗜酸性粒细胞炎症水平。(4)哮喘患者诱导痰上清液中sCD163水平与FEV1(r=-0.505,P=0.011)和FCV(r=-0.281,P=0.028)呈负相关。诱导痰上清液中sCD163浓度升高可能提示哮喘患者肺功能下降,但还需要更多相关研究。(5)PA组诱导痰上清液中IL-5(pg/ml)水平20.3(17.8,27.4)明显低于EA组29.8(23.0,55.3)(P0.01)及MA组37.2(29.2,79.9)(P0.05)。NA组诱导痰上清液中IL-8水平(pg/ml)24238(14831.8,28437.8)明显高于EA组17705.4(4124.3,20438.7)(P0.05)和PA组13938.4(2598.9,20361.7)(P0.05)。PA组诱导痰上清液中sCD163(pg/ml)水平:37.4(26.6,53.3)明显高于EA组:26.9(16.8,39.2)(P0.05)、MA组:28.25(18.0,37.2)(P0.05),差异具有统计学意义。不同哮喘炎症表型诱导痰炎症介质水平不同。(6)重症哮喘组患者诱导痰上清液sCD163水平:39.79(28.97,48.51)(P0.05)及血清sCD163:4.32(3.05-7.7)(P0.05)水平明显高于非重症哮喘组。sCD163有可能成为预测哮喘严重程度的一个生物指标,但还需要更进一步的研究。3.结论:(1)稳定期哮喘患者诱导痰中sCD163水平明显增高,提示sCD163参与了哮喘的发病和持续,可以作为哮喘气道炎症持续的生物标志物。哮喘患者诱导痰上清中sCD163水平高于其血清水平,说明与其他全身炎症因子相比,sCD163更可能成为哮喘患者气道内局限炎症反应水平的一个新型标志物。(2)哮喘患者诱导痰上清中sCD163水平与FEV1、FVC呈负相关,且重症哮喘组患者诱导痰上清液sCD163水平显著高于非重症哮喘组,提示sCD163可能具有评估哮喘严重程度的作用,sCD163可能成为早期判断肺功能受损的一项全新的生物指标。(3)不同哮喘炎症表型的哮喘其下呼吸道的炎症介质亦不相同。哮喘患者诱导痰上清液中sCD163与诱导痰IL-9、IL-5呈正相关,与血清IL-6呈负相关;血清s CD163与诱导痰上清IL-9呈负相关。诱导痰上清液中sCD163水平与诱导痰及血嗜酸性粒细胞呈负相关。sCD163更倾向于抑制气道内嗜酸性粒细胞性炎症。第3节:CD163+巨噬细胞在哮喘发病机制中的作用及临床意义1.实验方法:(1)流式细胞术检测哮喘患者及健康对照者外周血单个核细胞中CD163+CD14+单核细胞的比例。(2)进行人单核细胞株(THP-1)细胞培养,应用PMA诱导THP-1细胞系向M2型巨噬细胞转化,分别加入IL4及IL4+IL10诱导的M2巨噬细胞培养基刺激细胞,采用Real-time PCR和Western blot的方法检测M2巨噬细胞中CD163基因表达情况。2.结果:(1)哮喘患者组外周血CD14+CD163+单核细胞百分比:8.55%(5.05,11.60)明显低于健康对照组:27.68%(12.1,57.2)(P0.001);但两组间CD14+单核细胞百分比无明显差异。(2)Real time PCR结果显示通过PMA诱导THP-1细胞系向巨噬细胞转化后,分别加入IL-4及IL-4+IL-10刺激巨噬细胞,CD163 mRNA表达水平较未刺激的巨噬细胞显著增高(P0.05),且IL-4+IL-10刺激组细胞CD163 mRNA表达水平明显高于IL-4刺激组。Weastern blot结果也显示IL-4及IL-4+IL-10可刺激转化后的巨噬细胞中CD163蛋白表达显著增高(P0.05),且IL-4+IL-10组细胞CD163蛋白表达水平明显高于IL-4组。3.结论:(1)哮喘患者外周血中CD163+单核细胞/巨噬细胞显著低于正常人群,测可能与其胞葬功能降低有关,而哮喘患者气道中sCD163水平增加可能为一种炎症补偿。(2)IL-4可诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,CD163表达轻度升高;而抗炎因子IL-10可强烈刺激M2巨噬细胞高表达CD163,IL-4+IL-10联合刺激效果更强。据此我们推测CD163接受抗炎因子IL-10的正调节,但同时也受到促炎因子IL-4的正调节,因此我们推测CD163在哮喘中同时接受抗炎、促炎因子双重调节。CD163及巨噬细胞在哮喘中的抗炎作用及临床意义需要更进一步的研究证实。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25
【图文】：

巨噬细胞,相互调节,炎症细胞,免疫反应

5图1.1 巨噬细胞在活化及免疫反应过程中与各炎症细胞之间存在相互调节、相互制约的作用。当M0巨噬细胞受到炎症介质(IL-4、IL-10)等刺激后分化为M2巨噬细胞。来自Th17的IL-17可保护M2巨噬细胞不进入凋亡程序，而相反Th1分泌的IFN-γ则可促进M2巨噬细胞凋亡。M2巨噬细胞又可促进Treg细胞的活化。CD163是M2巨噬细胞表面清道夫受体，中性粒细胞活化释放的弹性蛋白酶可促进sCD163从巨噬细胞表面释放，同时M2巨噬细胞通过胞葬作用吞噬凋亡的中性粒细胞。注：IL-10：白介素 10；IL-6：白介素 6；IL-17：白介素 17；IL-4：白介素 4；Neutrophils：中性粒细胞；NE：中性粒细胞弹性蛋白酶；Treg：调节 T 细胞。Th1：辅助 T1 细胞；Th2：辅助 T2 细胞。1.3 sCD163 的分子结构CD163 分子量 130-kDa, 是清道夫受体家族成员之一，属于半胱氨酸富集的I 型跨膜蛋白，这一受体在 1987 年首次被发现[58]。CD163 的表达基本上是通过循环中的单核细胞和组织中的巨噬细胞受到一定刺激而诱导单核细胞/巨噬细胞合成实现的[12]。这些刺激包括细菌感染和一些炎症介质，报道显示 CD163 可以绑定入侵人体内的致病菌[18,26]，CD163 分子上有致病菌及肿瘤坏死因子-α 样弱诱导凋亡因子(TWEAK)的结合区域[49]。用免疫印迹(Western blot)分析 CD163 的变异体显示

炎症因子,巨噬细胞,表面

[27](图 1.2)。图1.2 膜CD163在受到一定炎症因子刺激后，在ADAM17/10作用下从巨噬细胞表面脱落，形成sCD163。CD163 (1044Arg-Ser-Ser-Arg)和Pro-TNF-a (78Arg-Ser- Ser-Ser-Arg)胞外区有相似的回文结构，作为酶切位点，接受蛋白酶水解[27,28]。注：MACROPHAGE: 巨噬细胞；IL-6：白介素6；IL-10：白介素10；IL-4：白介素4；Hb:血红蛋白；M-CSF:巨噬细胞集落刺激因子；Oxidative stess:氧化应激；ADAM10/17：A型结聚素和金属蛋白酶10/17；TNF-α:肿瘤坏死因子-α；CXCL4：趋化因子配体4；Enzumecutting site: 酶切位点。sCD163 和 IgG 与血浆中的游离的血红蛋白(Hb)相互作用，随后形成的sCD163-Hb-IgG 复合物被单核细胞的 FcγR 吞噬,在胞内被吞噬的 sCD163-Hb-IgG复合物释放 Hb 及 IgG 进入下一步循环，而 sCD163 则重新表达与细胞表面，形成一个sCD163吞噬内循环，以便维持单核

复合物,珠蛋白,巨噬细胞,血红蛋白

释放的可溶性 CD163 通过旁分泌反式激活内皮细胞，这种方式可以血红蛋(Hb)。就珠蛋白-血红蛋白(Hp-Hb)复合物的吸收与结合能力的 sCD163 与细胞表面膜 CD163 相比仅有微弱的竞争力，3-Hp-Hb 复合物的饱和状体只见于大量 Hp-Hb 复合物存在的情况。与膜 CD163 绑定后很少解离[34]。

【参考文献】