【摘要】：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种全身性自身免疫性疾病,主要特征为滑膜肿瘤样增生、滑膜炎症以及造成邻近的软骨与骨的破坏。在RA发病过程中,作为滑膜细胞中的主要细胞,活化的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)通过自身增殖与迁移积极参与RA的炎症过程,如产生促炎因子白介素(interleukin,IL)-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)等。FLS的过度增殖、迁移,以及侵入血管形成血管翳都是RA的病理特征之一;其通过自身的活化侵入邻近的软骨,分泌MMPs造成软骨的破坏;其还能分泌促炎因子加剧炎症反应。尽管RA的确切发病原因尚不清楚,但已被证实与FLS的增殖和迁移有着密切的关系。然而,目前对于激活FLS的增殖和迁移的分子机制知之甚少。有研究表明过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)-γ可能有助于抑制RA滑膜中促炎细胞因子的持续表达。PPAR-γ属于核激素受体家族,因其在调节参与葡萄糖稳态、脂质代谢和免疫应答中的作用而闻名。更重要的是,已知PPAR-γ在肿瘤中具有显著的抗炎活性和抗增殖作用。然而,PPAR-γ对RA中FLS增殖与迁移的作用及其机制仍未有文献报道。为了研究RA发病过程中PPAR-γ对RA中FLS增殖与迁移的作用及其机制,本课题进行了以下研究内容:1.PPAR-γ在大鼠AIA和RA患者关节滑膜细胞中的表达情况为了研究PPAR-γ在RA关节滑膜细胞中的作用,首先收集正常、骨关节炎(osteoarthritis,OA)和RA关节滑膜标本,以及建立大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AIA)模型。通过继发性足爪肿胀度、苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(western blot,WB)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-PCR)方法鉴定AIA模型的建立成功。通过HE、WB和q-PCR鉴定收集的RA患者滑膜的情况。使用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光(immunofluorescence,IF)、WB和q-PCR的方法发现,PPAR-γ在大鼠AIA和RA患者关节滑膜组织和FLS中低表达。2.PPAR-γ抑制剂T0070907对FLS增殖和迁移的作用首先通过q-PCR方法选择T0070907的合适浓度,结果发现浓度为12.5μM时PPAR-γ的表达最低。WB和q-PCR结果显示T0070907显著降低PPAR-γ蛋白和mRNA表达,并提高正常和AIA FLS中癌基因c-myc和细胞周期蛋白Cyclin D1的蛋白和mRNA表达。通过使用细胞周期分析、CFDA SE染色和BrdU细胞增殖检测发现T0070907能够显著增加AIA FLS的增殖。WB和q-PCR结果显示,在正常和AIA FLS中T0070907显著上调MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达,而下调基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1的表达。Wound-healing和Transwell检测发现T0070907显著增加正常和AIA FLS的迁移。同时,本课题还发现给予10ng/mL TNF-α刺激AIA FLS后,WB和q-PCR结果发现,T0070907同样能够促进TNF-α诱导的大鼠AIA和RA患者FLS中MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达上调,且抑制TIMP-1的表达。Wound-healing检测发现T0070907同样显著增加TNF-α诱导的大鼠AIA和RA患者FLS的迁移。3.PPAR-γ-RNAi对FLS增殖和迁移的作用WB和q-PCR结果显示PPAR-γ-RNAi显著降低正常和AIA FLS中PPAR-γ蛋白和mRNA表达,并提高c-myc和Cyclin D1的蛋白和mRNA表达。通过使用细胞周期分析、CFDA SE染色和BrdU细胞增殖检测发现PPAR-γ-RNAi能够明显增加AIA FLS的增殖。WB和q-PCR结果显示,在正常和AIA FLS中PPAR-γ-RNAi显著上调MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达,而下调TIPM-1的表达。Wound-healing和Transwell检测发现PPAR-γ-RNAi同样显著增加正常和AIA FLS的迁移。同时,本课题还发现给予10ng/mL TNF-α刺激AIA和RA FLS后,WB和q-PCR结果发现,PPAR-γ-RNAi同样能够促进TNF-α诱导FLS中MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达显著上调,并下调TIMP-1的表达。Wound-healing检测发现PPAR-γ-RNAi同样显著增加TNF-α诱导的AIA和RA FLS的迁移。4.PPAR-γ激动剂对FLS增殖和迁移的作用已经证实抑制PPAR-γ表达能够促进FLS的增殖和迁移,增加PPAR-γ表达是否影响FLS的增殖和迁移呢?WB和q-PCR结果显示PPAR-γ激动剂吡格列酮能够显著上调正常和AIA FLS中PPAR-γ蛋白和mRNA表达,并降低c-myc和Cyclin D1的蛋白和mRNA表达。同时使用细胞周期分析、CFDA SE染色和BrdU细胞增殖检测发现吡格列酮能够显著明显抑制正常和AIA FLS的增殖。WB和q-PCR结果显示给予PPAR-γ激动剂吡格列酮后,在正常和AIA FLS中显著下调MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达,而上调TIPM-1的表达。同时Wound-healing和Transwell检测发现吡格列酮显著抑制AIA FLS的迁移。本课题还发现给予10ng/mL TNF-α刺激AIA FLS后,WB和q-PCR结果发现,PPAR-γ激动剂吡格列酮和罗格列酮同样能够抑制TNF-α诱导的AIA和RA FLS中MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达,而上调TIPM-1的表达。同时,Wound-healing检测发现吡格列酮和罗格列酮同样显著抑制TNF-α诱导的AIA和RA FLS的迁移。5.PPAR-γ过表达质粒对FLS增殖和迁移的作用WB和q-PCR结果显示PPAR-γ过表达质粒PPAR-γ-N1能够显著升高正常和AIA FLS中PPAR-γ蛋白和mRNA的表达,并降低c-myc和Cyclin D1的蛋白和mRNA表达。通过细胞周期分析、CFDA SE染色和BrdU细胞增殖检测发现PPAR-γ-N1显著能够明显抑制正常和AIA FLS的增殖。使用WB和q-PCR结果显示转染PPAR-γ-N1后,在正常和AIA FLS中显著下调MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白表达,而上调TIPM-1的表达。Wound-healing和Transwell检测也发现PPAR-γ-N1显著抑制AIA FLS的迁移。同时,本课题还发现给予10 ng/mL TNF-α刺激AIA和RA FLS后,WB和q-PCR结果发现,PPAR-γ过表达质粒同样能够抑制TNF-α诱导FLS中MMP-3和MMP-9mRNA和蛋白表达。Wound-healing检测发现PPAR-γ过表达质粒同样显著抑制TNF-α诱导AIA和RA FLS的迁移。6.PPAR-γ可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控细胞增殖与迁移通过WB结果显示,通过T0070907(12.5μM)或PPAR-γ-RNAi抑制PPAR-γ表达后,在正常和AA FLS中β-catenin表达显着增强。特别地是,吡格列酮(25μM)或PPAR-γ-N1能够抑制β-catenin的表达。而且使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939处理后PPAR-γ-RNAi不能增加起FLS中c-Myc,Cyclin D1,MMP-3和MMP-9蛋白的表达变化。提示PPAR-γ通过Wnt/β-catenin信号通路调控细胞增殖与迁移。RA发病过程中,炎症反应是主要的特征之一,也是造成患者出现并发症的主要源头之一。滑膜组织中的增生的FLS能够通过分泌促炎因子、趋化因子和MMPs到滑膜液中,从而招募更多的T细胞和B细胞等加剧关节滑膜的炎症反应,如RA中的TNF-α、IL-6、单核细胞趋化蛋白(mono-cyte chemotactic protein,MCP,CCL)-2和MMP-3等。而T细胞和B细胞还会分泌更多的促炎因子和趋化因子加剧关节滑膜的微环境。因此表明如何抑制炎症的产生也是治疗RA的关键方法之一,也是目前研究的热点。据报道PPAR-γ能够调节葡萄糖稳态,胰岛素敏感性,脂质代谢,免疫应答,细胞命运和炎症。研究发现滑膜组织和单核细胞中PPAR-γ的表达与RA的炎症评分呈正相关,提示PPAR-γ可能参与RA炎症的发生。但是,在RA发病过程中PPAR-γ对FLS中炎症因子表达和分泌的影响未见报道。为了研究RA发病过程中PPAR-γ对RA中FLS炎症因子表达和分泌的作用及其机制,本课题进行了以下研究内容:1.多种炎症因子对FLS中PPAR-γ的表达影响首先检测炎症因子对FLS中PPAR-γ的表达,WB和q-PCR检测发现,使用不同的炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、干扰素(interferon,IFN)-γ和脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激大鼠AIA和RA患者中FLS,结果发现PPAR-γ蛋白和m RNA表达都有不同程度的降低,其中IL-17A和TNF-α刺激组PPAR-γ下调最大。2.T0070907对FLS中炎症因子表达和分泌的影响通过WB和q-PCR检测发现,使用T0070907抑制PPAR-γ表达后能够促进正常和AIA FLS中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白和m RNA的表达。ELISA检测发现T0070907还能够显著促进大鼠FLS中IL-6和TNF-α的分泌。q-PCR还发现T0070907还能明显促进大鼠FLS中趋化因子CCL-2和CCL-3、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)的m RNA的表达。同时,给予TNF-α刺激FLS后,T0070907同样能够促进炎症因子AIA和RA FLS中IL-1β、IL-6和IL-17A m RNA和蛋白的表达。ELISA还发现T0070907同样能够提高TNF-α诱导的RA FLS细胞上清中IL-6和IL-8的表达。q-PCR还发现T0070907同样能够促进TNF-α诱导的AIA和RA FLS中趋化因子CCL-2、CCL-3和CCL-8 m RNA的表达升高。3.PPAR-γ-RNAi对FLS中炎症因子表达和分泌的影响通过WB和q-PCR检测发现,使用PPAR-γ-RNAi能够促进正常和AIA FLS中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。使用ELISA检测发现PPAR-γ-RNAi能够显著促进大鼠FLS中IL-6和TNF-α的分泌。q-PCR还发现PPAR-γ-RNAi还能明显促进大鼠FLS中CCL-2和CCL-3、VCAM-1的m RNA的表达。同时,给予TNF-α刺激FLS后,PPAR-γ-RNAi还同样能够促进炎症因子AIA和RA FLS中IL-1β、IL-6和IL-17A m RNA和蛋白的表达。ELISA检测还发现PPAR-γ-RNAi同样能够提高RA FLS细胞上清中IL-6和IL-8的表达。q-PCR还发现PPAR-γ-RNAi同样能够促进TNF-α诱导的AIA和RA FLS中CCL-2、CCL-3和CCL-8 m RNA的表达升高。4.PPAR-γ激动剂对FLS中炎症因子表达和分泌的影响WB和q-PCR结果表明,PPAR-γ激动剂吡格列酮和罗格列酮能够增加PPAR-γ表达,且抑制正常和AIA FLS中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。ELISA发现吡格列酮和罗格列酮能够显著抑制大鼠FLS中IL-6和TNF-α的分泌。q-PCR还发现吡格列酮和罗格列酮还能显著降低大鼠FLS中CCL-2和CCL-3、VCAM-1的m RNA的表达。同时,给予TNF-α诱导FLS后,吡格列酮和罗格列酮同样能够抑制AIA和RA FLS中炎症因子IL-1β、IL-6和IL-17A m RNA和蛋白的表达。ELISA检测还发现吡格列酮和罗格列酮同样能够降低RA FLS细胞上清中IL-6和IL-8的表达。q-PCR还发现吡格列酮和罗格列酮同样能够抑制TNF-α诱导的AIA和RA FLS中CCL-2、CCL-3和CCL-8 m RNA的表达。同时体内实验AIA大鼠给予吡格列酮和罗格列酮灌胃治疗后,IHC、IF、WB和q-PCR都发现滑膜组织中PPAR-γ表达与AIA组比较明显升高。通过HE、大鼠继发性足爪肿胀度、WB和q-PCR检测发现,给予吡格列酮和罗格列酮后大鼠滑膜组织中的炎症细胞的浸润显著降低,且抑制大鼠滑膜组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α的表达。ELISA法也显示吡格列酮和罗格列酮显著抑制AIA血液上清中IL-6和TNF-α的表达。5.过表达PPAR-γ对FLS中炎症因子表达和分泌的影响WB和q-PCR结果表明,PPAR-γ过表达质粒PPAR-γ-N1能够增加PPAR-γ表达,且抑制正常和AIA FLS中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。ELISA发现PPAR-γ-N1能够显著抑制大鼠FLS中IL-6和TNF-α的分泌。q-PCR还发现PPAR-γ-N1还能显著降低大鼠FLS中CCL-2和CCL-3、VCAM-1的m RNA的表达。同时,给予TNF-α诱导FLS后,PPAR-γ过表达质粒同样能够抑制AIA和RA FLS中炎症因子IL-1β、IL-6和IL-17A m RNA和蛋白的表达。ELISA检测还发现PPAR-γ过表达质粒能够降低RA FLS细胞上清中IL-6和IL-8的表达。q-PCR还发现PPAR-γ过表达质粒能够抑制TNF-α诱导的AIA和RA FLS中CCL-2、CCL-3和CCL-8 m RNA的表达。同时体内实验AIA大鼠给予原位注射PPAR-γ过表达腺病毒治疗后,IHC、IF、WB和q-PCR都发现滑膜组织中PPAR-γ表达与AIA组比较明显升高。通过HE、大鼠继发性足爪肿胀度、WB和q-PCR检测发现,给予PPAR-γ过表达腺病毒后大鼠滑膜组织中的炎症细胞的浸润显著降低,且抑制大鼠滑膜组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α的表达。ELISA法也显示PPAR-γ过表达腺病毒显著抑制AIA血液上清中IL-6和TNF-α的表达。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22
【图文】：
安徽医科大学博士学位论文滑膜细胞中的表达变化节炎模型的建立-γ在 RA 滑膜细胞中的表达变化，首先建变化射弗氏完全佐剂 24 天后，发现 AIA 组继 AIA 组尾根部出现数量不等、大小不一的
图 1 大鼠足爪及整体变化足踝肿胀度变化佐剂 15 天后，开始测量大鼠继发性足踝肿胀束。如图 2 所示，随着时间增加大鼠继发性足 组足踝肿胀度就显著高于正常组，且差异水平 天达到最高峰，之后有轻微的降低。
安徽医科大学博士学位论文) 大鼠滑膜组织 HE 染色在大鼠造模过程中，每 7 天收集膝关节滑膜组织，通过 HE 染色检测滑膜中炎症浸润情况，观察 AIA 模型的建立过程。如图 3 所示，随着造模时间加，滑膜组织中炎症细胞的浸润也随之加大，并在第 28 天达到最高；第开始，滑膜组织衬里层中存在大量的炎症细胞浸润，而衬外层没有什么变且，还观察到滑膜层也随着时间逐渐增加，且第 28 天达到最高。
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2760334
