藤黄酸治疗破骨细胞相关骨溶解疾病的机制研究

发布时间：2020-08-04 07:57

【摘要】：骨质疏松症是危害老年人健康的主要因素之一,已成为危害人群死亡的第四大因素。作为一种系统性骨病,骨质疏松主要表现为骨量下降、骨微结构退化、骨脆性增加等,可引引起患者全身关节酸痛、腰背疼痛甚至骨折,大大降低了患者的生活质量,同时也给家庭、社会带来了巨大的负担与压力。随着人口的老龄化的加速,预计到2020年,我国骨质疏松患者将达到2.86亿。骨质疏松症已迅速发展成为我国的一个公共健康问题,对于骨质疏松症的正确认识和早期干预迫在眉睫。成骨细胞和破骨细胞是骨重建中维持骨量最主要的两种细胞。破骨细胞是人体内唯一吸收骨质的细胞,在生理情况下,与成骨细胞一起维持正常骨组织的代谢平衡。当破骨细胞数量增加或者骨吸收功能增强时,可引起包括骨质疏松症、骨关节炎、Paget骨病、肿瘤骨转移在内的多种由于骨量过度丢失而导致的常见疾病。深入开展破骨细胞研究在国内国外均具有非常重要的临床诊疗价值、基础研究价值和社会经济价值。尽管传统的药物包括二磷酸盐类(Bisphosphonate),降钙素(Calcitonin),雌激素(Estrogen)和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)等均能一定程度上治疗破骨细胞相关疾病,但尚存在骨坏死以及肿瘤等并发症的报道。研发新型的具有靶向性和特异性的抗破骨细胞骨吸收药物,减少其副作用,是下一步研究的方向。最近,天然提取物作为药物在调控破骨细胞形成、预防和治疗破骨细胞相关骨溶解疾病方面开始受到重视。在前期药物对破骨细胞分化抑制筛选过程中,我们发现中药单体藤黄酸能有效抑制破骨细胞的分化成熟和骨吸收功能。因此,本研究将进一步深入研究藤黄酸在抑制破骨细胞分化成熟过程中的分子生物学机制,并通过动物实验研究藤黄酸在预防和治疗破骨细胞相关疾病中的作用,为临床转化应用提供充分的细胞生物学和动物学研究基础。目的(1)研究藤黄酸在抑制破骨细胞分化成熟过程中的分子生物学机制；(2)将藤黄酸应用于破骨细胞相关的骨溶解疾病动物模型-小鼠OVX模型,在体内证明该中药单体的安全性和有效性；(3)为中药单体临床转化应用提供研究基础。方法使用6周C57雌鼠的骨髓细胞作为细胞源,进行破骨细胞的体外培养,利用TRAP染色,3个核染色阳性的细胞认定为破骨细胞；使用CCK-8试剂盒测定藤黄酸对细胞的毒性,计算半数抑制浓度IC50；通过牛骨片吸收试验研究不同浓度藤黄酸对破骨细胞骨吸收能力的影响,使用电镜扫描牛骨片表面,然后对骨吸收区域进行分析；使用qRCR来测定破骨细胞分化过程中特异性基因的表达量；使用蛋白电泳来测定GBA抑制破骨细胞分化与吸收功能的靶向信号通路。为了进一步验证藤黄酸在体内对骨质疏松的作用,我们建立了小鼠OVX骨质疏松动物模型。造模一周后,根据组别腹腔注射不同的液体每周两次,连续四周。最后收集所有小鼠的双侧股骨和胫骨标本,放入4%的多聚甲醛进行固定,然后分别行组织学切片和micro-CT扫描分析。结果毒性试验证实在低于120nnM浓度的藤黄酸条件下,药物对细胞活性不会产生明显影响。而当藤黄酸浓度高于240nM时,药物对细胞活性有影响。同时我们计算出藤黄酸对BMMs的半数抑制浓度IC50为320nM。藤黄酸对破骨细胞分化的抑制作用呈浓度梯度依赖。我们将BMMs在无菌的牛骨片上进行培养,加入不同浓度的藤黄酸,结果空白组牛骨片上出现大量骨吸收,而在60nM组,骨吸收的区域减少到了约60%,在80nM组为20%,在120nM组几乎看不到骨吸收现象。以此我们可以看出藤黄酸可抑制破骨细胞的骨吸收功能。我们将藤黄酸应用于小鼠OVX模型,利用micro-CT、HE切片染色、TRAP切片染色观察不同浓度藤黄酸对OVX小鼠的影响。OVX小鼠的BV/TV(骨体积分数)较正常小鼠有明显的下降。不同浓度藤黄酸组的骨体积分数比OVX对照组均有提高。并且藤黄酸的应用提高了OVX小鼠的Tb.N(骨小梁数),降低了Tb.Sp(骨小梁间隙)。我们检测了破骨细胞特异性基因的表达情况,在RANKL的刺激下,这些基因的表达出现了明显的增高,但是在藤黄酸药物组,基因表达有着不同程度的下降,并且藤黄酸对破骨细胞特异性基因的表达抑制呈剂量和时间依赖相关。这些数据进一步证明藤黄酸在体外可以抑制破骨细胞的分化。我们研究了藤黄酸对破骨细胞分化相关的主要信号通路包括NF-κ.B、P13K/Akt和MAPK信号通路的影响。p38在RANKL刺激5min后出现磷酸化,而在藤黄酸药物组中,p38的磷酸化出现了减弱。JNK出现了类似于p38的情况,Akt在RANKL刺激10min后出现了明显的磷酸化,然后藤黄酸降低了Akt的这种磷酸化。另外,藤黄酸对于NF-κB和ERK的磷酸化没有影响。P38和JNK的下游信号通路c-Fos和c-Jun在藤黄酸的作用下出现了明显的降低。这些数据表明藤黄酸可能通过抑制p38、JNK和Akt通道来抑制破骨细胞的分化与功能。为了进一步确认该结果,我们在试验中添加了p38和JNK的激动剂茴香霉素。同样的,我们可以观察到破骨细胞的形成在单独使用藤黄酸的情况下被明显抑制,而在同时加入藤黄酸和茴香霉素的实验组里,破骨细胞形成的抑制效应被明显降低。同时我们也看到在藤黄酸和茴香霉素共同作用组中,p38和JNK的磷酸化要明显高于单独使用藤黄酸的实验组。我们使用小鼠p38、JNK1和JNK2计算机结构模型分析了藤黄酸是否在结构上存在JNK和p38蛋白的结合位点,结果发现藤黄酸与p38、JNK1和JNK2都存在较为合适的结合位点。以上数据表明,藤黄酸可以通过抑制p38和JNK信号通路来抑制破骨细胞的形成。结论本研究表明藤黄酸在体内和体外实验中均可以抑制破骨细胞的形成和破骨细胞的骨吸收功能,从而我们推测藤黄酸具有治疗破骨细胞相关疾病的潜在价值。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580
【图文】：

先期研究中我们发现藤黄酸可科抑制破骨细胞的分化，所ＬNB我们进一步研究逡逑了藤黄酸是否可巧制破骨细胞的骨吸收作用。我们将ＢＭＭｓ细胞在无菌的牛骨逡逑片上进行培养，加入不同浓度的藤黄酸，如图２所示，空白组牛骨片上出现大量逡逑骨吸收，而在６０ｎＭ浓度的藤黄酸组，骨吸收的区域减少到了约６０％，在８０ｎＭ组逡逑为２０％，在１２０ｎＭ组几乎看不到骨巧收现象。Ｗ此我们可科看出藤黄酸可巧制破逡逑骨细胞的骨吸收功能。逡逑■Ａ栜自逡逑，b8逡逑１７逡逑

诱导的ＲＡＷ２６４．７细胞释放促炎因子ｔｉｉ’ｉ２１。所Ｗ我们捡测了邋ＧＢＡ对促炎因子释放逡逑的抑制作用是否是通过减少ＮＯ的生成达成的，我们通过捡测细胞培养上清液中逡逑的亚硝酸盐（ＮＯ２－）含量来间接判定ＮＯ的量。如图２Ａ所示，８０ｎＭ和１６０ｎＭ的逡逑ＧＢＡ可Ｗ抑制亚硝酸盐的产量。蛋白电泳表明１６０ｎＭ的ＧＢＡ可Ｌ义明显巧制ｉＮＯＳ逡逑的表达（图述）。］＾？８可＾通过激活师－浊信号遁路来提高ｉＮＯＳ和ＮＯ的表达逡逑所Ｗ我们枪测了邋ＧＢＡ处理之后ＮＦ－ｋＢ信号通路的激活情况。如图２Ｃ所示，ＬＰＳ逡逑虽著激活转染了邋ＮＦ－ｋＢ巧光素酶的ＲＡＷ２６４．７细胞的ＮＦ－ｋＢ表达，而１６０ｎＭ的逡逑邸Ａ可レNB巧制ＮＦ－ｋＢ的激活。蛋白电泳表明１６０ｎＭ的ＧＢＡ可１＾义显著抑制ＬＰＳ逡逑诱导的降解（图２Ｄ）。逡逑然而，在化浓度（２０ｎＭ、４０ｎＭ和８０ｎＭ）的ＧＢＡ作用下，ＮＯ和ｉＮＯＳ的逡逑表达并没有改变，而且ＮＦ－ｋＢ信号通路在此浓度的ＧＢＡ作用下依旧处于激活状态。逡逑但是高浓度（１２０ｎＭ）的ＧＢＡ可１＾NB抑制ＮＦ－ｋＢ信号通路的激活，同时巧制ｉＮＯＳ和逡逑ＮＯ的表达。逡逑５９逡逑

先期研究中我们发现藤黄酸可科抑制破骨细胞的分化，所ＬNB我们进一步研究逡逑了藤黄酸是否可巧制破骨细胞的骨吸收作用。我们将ＢＭＭｓ细胞在无菌的牛骨逡逑片上进行培养，加入不同浓度的藤黄酸，如图２所示，空白组牛骨片上出现大量逡逑骨吸收，而在６０ｎＭ浓度的藤黄酸组，骨吸收的区域减少到了约６０％，在８０ｎＭ组逡逑为２０％，在１２０ｎＭ组几乎看不到骨巧收现象。Ｗ此我们可科看出藤黄酸可巧制破逡逑骨细胞的骨吸收功能。逡逑■Ａ栜自逡逑，b8逡逑１７逡逑

本文编号：2780265