B细胞中JAK1-STAT1通路活化的机制及其在SLE中的作用

发布时间：2020-08-06 21:42

【摘要】：系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及多器官、多系统,临床表现复杂的自身免疫性疾病,其主要病理特征是患者血清中存在大量的IFN-a及自身抗体,尤其是抗dsDNA抗体。目前认为其发病主要由多种因素相互作用,但是其确切的发病机制仍然不清。大量研究表明,B细胞作为抗体分泌细胞是SLE发病的直接参与者,并且SLE患者的B细胞处于高度活化状态。SLE患者血清中也存在大量的IFN-a,并且与疾病活动程度及抗dsDNA抗体的滴度显著相关,SLE患者体内干扰素诱导基因显著高表达。已报道IFN-a诱导的JAK1-STAT1通路异常活化在SLE的发病中发挥关键性的作用,IFN-a能够通过激活JAK1-STATl通路显著地调控B细胞的生存、活化、抗体分泌等功能。我们前期研究也发现,SLE患者外周血B细胞中干扰素诱导基因显著高表达,其JAK1-STAT1通路过度活化。值得注意的是,SLE发病具有明显的性别倾向,男女发病比例为1：9,并且已有研究表明雌激素在SLE的发病过程中发挥重要的作用。可是,迄今还不完全清楚：①IFN-α与雌激素是否能够相互作用影响SLE患者的B细胞；②什么因素导致SLE患者B细胞中IFN-a激活的主要信号途径JAK1-STAT1通路过度活化。因此,本论文从以下三个方面深入探索了调控B细胞中JAK1-STAT1通路活化的因素及其具体作用机制,以便为人们更好的理解和探索SLE发病的机制提供一定的理论基础。1.雌激素通过IKK-ε促进B细胞中IFN-a诱导的JAK1-STAT1通路活化已有研究表明雌激素能够促进SLE的发病；IFN-α能够促进SLE的发生发展且SLE患者B细胞中JAK1-STAT1通路过度活化。但是目前仍不清楚雌激素是否参与调控B细胞中JAK1-STAT1通路的活化。我们首先利用基因芯片分析健康男女外周血CD19+B细胞中基因表达的差异。有趣的是,与健康男性相比,健康女性外周血B细胞中多种干扰素诱导基因显著高表达。进一步研究发现,与雄性C57BL/6小鼠相比,雌性C57BL/6小鼠脾脏B220+B细胞同样高表达多种干扰素诱导基因。为了研究这种性别差异是否与雌激素有关,我们对雌性C57BL/6小鼠做了卵巢切除手术,并用主要的雌激素—雌二醇或安慰剂分别处理小鼠4周。结果显示,与安慰剂处理的切卵巢小鼠相比,雌二醇处理的切卵巢小鼠脾脏B细胞中多种干扰素诱导基因明显高表达。我们的体外研究发现,雌激素不仅能够促进小鼠B细胞中IFN-α诱导的JAK1-STAT1通路的活化,而且能够增强IFN-α对B细胞增殖、活化的促进作用,其具体机制为：雌激素通过下调非编码微小RNA.(microRNA) let-7e-5p、miR-98-5p 以及 miR-145a-5p(均能够靶向IKK-ε的3'UTR区)的表达促进IKK-ε的表达；IKK-ε通过促进STAT1的磷酸化促进IFN-α诱导的JAK1-STAT1通路的活化。不仅如此,与雄性C57BL/6小鼠相比,雌性C57BL/6小鼠脾脏B细胞中let-7e-5p、miR-98-5p 以及 miR-145a-5p的表达显著下调,而IKK-ε的表达显著上调。同时,我们还检测了健康男女外周血PBMCs中let-7e-5p、miR-98-5p、miR-145a-5 p以及IKK-ε的表达。结果显示,与健康成年男性相比,健康成年女性PBMCs中let-7e-5p、miR-98-5p以及miR-145a-5p的表达显著下调,而IKK-ε的表达显著上调。以上研究结果表明,雌激素能够通过上调IKK-ε促进IFN-α诱导的JAK1-STAT1通路的活化进而调控B细胞的活化,提示雌激素对B细胞中JAK1-STAT1通路活化的促进作用可能是SLE发病具有明显性别倾向的机制之一。2. STS-1-c-cbl-Tyk2信号轴通过促进JAK1-STAT1通路活化调控B细胞自噬SLE患者B细胞中JAK1-STAT1通路过度活化；而JAK1-STAT1通路在IFN-I诱导细胞自噬的过程中发挥至关重要的作用。最新研究表明,SLE患者及NZB/WF1狼疮小鼠B细胞中自噬水平明显升高,自噬能够通过调控B细胞的分化、生存及抗体分泌等功能促进SLE的发生发展。但是SLE患者B细胞中JAK1-STAT1通路过度活化的具体机制仍不完全清楚,并且导致SLE患者B细胞中自噬水平增强的原因是什么呢?我们通过分析本实验室前期的SLE患者外周血CD19+B细胞基因芯片从中筛选出一个在SLE’患者外周血B细胞中显著高表达的基因STS-1。为了进一步验证STS-1是否在SLE患者以及MRL/lpr狼疮小鼠中高表达,我们磁珠分选了SLE患者外周血CD19+B细胞以及MRL/lpr狼疮小鼠脾脏B220+B细胞,并通过Q-PCR验证SLE患者以及MRL/lpr小鼠的B细胞中STS-1的确显著高表达。进一步研究发现,TLR7、TLR9以及BCR通路参与调控B细胞中STS-1的表达。接下来我们深入研究了STS-1对B细胞中JAK1-STAT1通路活化的调控作用,令人惊奇的是STS-1能够显著促进IFN-α诱导的JAK1-STAT1通路活化,其具体机制为：STS-1通过结合并抑制c-cbl的磷酸化促进Tyk2的磷酸化,进而促进IFN-a诱导的JAK1-STAT1通路活化。此外,我们还发现STS-1能够通过去磷酸化Syk抑制IFN-α诱导的PI3K-mTOR通路的活化。有趣的是,IFN-α能够通过激活JAK1-STAT1通路诱导人外周血CD19+B细胞以及小鼠脾脏B220+B细胞发生自噬,而STS-1能够显著促进Raji细胞中IFN-α诱导的自噬。最后我们发现MRL/lpr狼疮小鼠脾脏B220+B细胞中自噬水平的确显著增强。以上研究结果表明,STS-1显著促进B细胞中IFN-a诱导的JAK1-STAT1通路活化及自噬发生,这就提示STS-1可能是治疗SLE的新靶点。3. dsDNA直接激活B细胞中JAK1-STAT1通路鉴于JAK1-STAT1通路在B细胞分化、抗体分泌以及自噬等过程中发挥重要的调控作用,那么除了IFN-α之外是否还存在其他因素能够激活B细胞中JAK1-STAT1通路呢?已有研究报道,SLE患者体内含有大量的抗dsDNA自身抗体,而双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)能够诱导IFN-I的分泌从而间接激活JAK1-STAT1通路,并且干扰素刺激基因(STING)在dsDN A识别的过程中发挥关键的作用。但是目前还不完全清楚dsDNA是否能够直接调控JAK1-ST AT1通路的活化以及STING在其中发挥什么作用。我们研究发现dsDNA通过磷酸化Lyn直接激活B细胞中JAK1-STAT1通路。有趣的是,STING能够促进SHP-1/2的磷酸化进而抑制dsDNA对JAK1-STAT1通路的激活作用。进一步研究发现STING在SLE患者及MRL/lpr狼疮小鼠脾脏B细胞中显著低表达,dsDNA.TLR7和TLR9介导的信号通路能够显著抑制B细胞中STING的表达。以上研究表明,dsDNA能够直接激活B细胞中JAK1-STAT1信号通路,而STING在其中发挥负调控作用；STING在SLE患者及MRL/lpr小鼠B细胞中低表达可能与JAK1-STAT1通路过度活化有关。综上所述,我们首先利用基因芯片发现健康男女外周血B细胞中干扰素诱导基因的表达存在显著差异,进一步研究发现雌激素通过上调IKK-ε的表达促进B细胞中JAK1-STAT1通路的活化进而调控B细胞的增殖、活化；其次,我们发现在STS-1在SLE患者外周血B细胞中显著高表达,并且其能够结合并抑制c-cbl的磷酸化调控B细胞中JAK1-STAT1通路的活化及自噬发生。有趣的是,我们还发现dsDNA通过磷酸化Lyn直接激活B细胞中JAK1-STAT1通路。本论文从不同角度深入研究了调控SLE患者B细胞中JAK1-STAT1通路活化的因素及其具体作用机制,我们的研究结果不仅为人们深入理解和探索SLE的发病机制提供新的理论基础,而且为SLE的临床治疗提供新的视角。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241
【图文】：

Ｎ－ａ通过诱导ＢＡＦＦ的表达促进Ｂ细胞的增殖、活化及抗ＢＡＦＦ在ＳＩ＾Ｅ患者体内水平明显升高［５２－５５］，ＢＡＦＦ转基状［５６－５８］，而且ａｎｔｉ－ＢＡＦＦ单抗能够巧效缓解化Ｅ的病情，ＢＡＦＦ能够促进生发中必形成、Ｂ纳胞化存及抗体转换［ＩＦＮ－ａ能够调控ＤＣｓ和巨晦细胞产生ＢＡＦＦ邋［４９－５１］。由此ＢＡＦＦ的表达间接调控Ｂ细胞的生存Ｗ及抗体转换。逡逑Ｎ－ａ能够诱导细胞死亡，清理不彻底的细胞调亡碎片可作细胞或者激活其他抗原地呈细胞，运些抗原递呈细胞激毒性Ｔ细胞产生更多的细胞碎片或促进Ｂ细胞分化，进ＳＬＥ临床症状［６４］。逡逑Ｎ－ａ能够上调Ｂ细胞中ＴＬＲ７的表达。ＴＬＲ７高表达能够促激活Ｂ细胞［６５］。研究发现，幼稚Ｂ细胞中ＴＬＲ７的表达

，。［１６０，１６１］，ｄｓＤＮＡ能够激活免疫反应，促进自身反应性抗体的产化进邮促进ＳＬＥ逡逑的发病［１６２－１６４］。逡逑现有的研究表明，细胞识别ＤＮＡ主要依赖于ＴＬＲ９、民ＩＧ－Ｉ及细胞质内的逡逑ＤＮＡ感受器如ＡＩＭ２、ｃＧＡＳ、ＬＲＲＦＩＰ１和ＺＢＰ１等（如图５所示）。最新研究发逡逑现一种新的蛋白，干扰素基因刺激因子（ＳＴＩＮＧ）在细胞识别来源于ＤＮＡ病原逡逑体、坏死或非正常死亡的胞质ＤＮＡ的过程中发挥至关重要的作用［１６５－１６７］。胞逡逑质ＤＮＡ通过激活ＳＴＩＮＧ－ＴＢＫ１－ＩＲＦ３信号通路促进细胞分泌细胞因子，其中最逡逑重要的便是ＩＦＮ－Ｉ。己有许多研究发现ＳＴＩＮＧ及其相关的信号通路在许多炎症义逡逑自身免疫性疾病的发病过程中发挥关键作用［１６５，１６８］。然而，Ｓｈａｒｍａ等人最新逡逑的研究表明敲除ＳＴＩＮＧ能够促进狼疮小鼠发病，进一步研究发现敲除ＳＴＩＮＧ的逡逑狼疮小鼠中自身抗体明显高于普通的狼疮小鼠［１６９］。由此可见，ＳＴＩＮＧ在ＳＬＥ逡逑发病中的具体作用还不是很明确。逡逑逦…逡逑

接下来我们借助生物信息学分析，研究了这些差异表达基因的功能。我们逡逑首先采用基于Ｇｅｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ数据库的ＧＯ分类法（基因本体论）对这些ＤＥＧｓ逡逑进行基因功能分析。如图１－２所示，这些差异表达的基因广泛的参与多种生物学逡逑过程，比如细胞表面受体相关的信号转导、转录及蛋白转运等。逡逑ＡＵ邋ＤＥＧｓ逡逑泌１逡逑乻邋ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ逡逑１１１邋１邋Ｊ邋１＝１１邋ＩＩ邋ｌｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑ｊ＇ｌ劶Ｉ悬！呡Ｉ呈Ｉ邋！§■邋Ｉ昔｜邋！■邋Ｉ逡逑量Ｉ灥呈ｅ邋ｓ逡逑Ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌｅｖａｎｔ邋ＤＥＧｓ逡逑－ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ逡逑ｙ邋Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦｝逡逑Ｗｌ＇ｌｉｌ邋Ｉ邋．１邋ｉｆ邋ｉｌ邋ｌｌ邋ｉｔ邋１ｉ逡逑３声５与置芒己ｉ宝！邋吾亏ａ邋Ｉ邋Ｉ？直已含逡逑

本文编号：2783004