胶原诱导性关节炎大鼠体内输注耐受性树突状细胞微嵌合状态的观察

发布时间：2020-08-08 09:01

【摘要】：目的:观察耐受性树突状细胞(dendritic cells,DC)在输入胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠体内后能否形成微嵌合状态,探讨耐受性DC对CIA大鼠治疗干预的内在机制。方法:以CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠为实验动物。1.核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)寡核苷酸诱骗策略(oligodeoxynucleotidedecoy,ODNDecoy)诱导 CIA 雌性 SD 大鼠和正常雄性SD大鼠来源耐受性DC的构建:(1)正常雌性SD大鼠左足跖部皮内注射200μl牛二型胶原(BIIC)乳剂进行CIA模型制备;(2)取CIA雌性SD大鼠(初次免疫后第13天)和正常雄性SD大鼠脾脏单个核细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)培养为DC,经NF-κB ODN Decoy诱导为耐受性DC:(3)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的培养细胞各分为4组;(4)DC生物学性状观察:倒置显微镜、吉姆萨染色观察细胞形态特征,台盼蓝染色计数活细胞率,流式细胞术检测大鼠DC特异性标志OX-62鉴定纯度,检测DC表面CD80、CD86分子表达情况和同种异体混合淋巴细胞反应评估耐受性DC的耐受性及其稳定程度。2.CIA大鼠体内输入耐受性DC微嵌合状态的观察:(1)制备CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的耐受性DC,并负载BIIC,记为BIIC-Decoy DC,用DiR荧光染料标记,记为BIIC-DecoyDC(?);(2)台盼蓝染色评估细胞标记DiR荧光染料前后活细胞率,MTT实验评价BIIC-Decoy DC(?)对细胞活性的影响;(3)活体成像系统(In Vivo Imaging System,IVIS)观察BIIC-Decoy DC(?)荧光强度;(4)IVIS活体成像实验分组:A组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?),于病程第5天,尾静脉输入CIA大鼠(即病程早期CIA)体内;B组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?),于病程第20天,尾静脉输入CIA大鼠(即病程中期CIA)体内;C组:CIA大鼠自体来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入病程中期CIA大鼠体内。正常雌鼠对照(normal female control,NFc)组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入正常雌性SD大鼠体内;正常雄鼠对照(normal male control,NMc)组:正常雄性SD大鼠自体来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入正常雄性SD大鼠体内。非标记细胞对照(cell control):用无荧光标记的BIIC-Decoy DC代替标记细胞,作为A、B、C组的非标记细胞对照,记为Acc、Bcc、Ccc组。模型空白对照(model control):用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)代替标记细胞,作为A、B、C组的模型空白对照,记为Amc、Bmc、Cmc组。(5)IVIS活体成像:将上述两种来源BIIC-Decoy DC(?)经尾静脉输入各组大鼠体内后4h、24h、5day、10day、20day、25day等时间点,动态观察细胞进入大鼠体内后的迁移、分布及微嵌合状态;(6)活体成像结束后检测指标:取离体脏器进行IVIS成像;取血清检测IL-2和IFN-y;IL-4和IL-10等细胞因子水平;取踝关节作病理切片。结果:(1)耐受性DC的构建:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源脾脏单个核细胞成功诱导为耐受性DC,其活细胞率均94%,细胞纯度均85%;DC表面CD80、CD86分子表达情况和同种异体混合淋巴细胞反应结果显示其耐受性具有较好的稳定程度;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的耐受性DC负载BIIC,成功构建BIIC-Decoy DC,标记DiR荧光染料,记为BIIC-Decoy DC(?);(3)台盼蓝染色:DiR荧光染料标记前后BIIC-Decoy DC活细胞率均在95%左右;(4)MTT实验:结果显示DiR荧光染料标记上述两种来源BIIC-Decoy DC后,对其细胞活性无影响;(5)IVIS成像检测结果显示DiR荧光染料成功标记上BIIC-Decoy DC,且荧光强度随细胞数量增加而增强;(6)IVIS活体成像结果:荧光信号主要集中在胸腹部,随成像时间延长可向其他部位迁移,如四肢关节;荧光强度随成像时间延长而逐渐降低;荧光信号多以24h达高峰,最长观察至第35天,仍可见荧光信号;(7)离体器官IVIS成像结果:荧光信号主要集中在肺脏、脾脏和淋巴结中,以肺脏荧光信号最强,肝脏、心脏和肾脏荧光信号相对较弱;(8)血清细胞因子水平检测:在病程早期和病程中期CIA大鼠模型组中,IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子表达水平较高,IL-10、IL-4等Th2型细胞因子较低;而在病程早期和病程中期CIA大鼠治疗组中,IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子表达明显降低,IL-10、IL-4等Th2型细胞因子表达明显升高;(9)踝关节病理结果:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC对病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均显示出良好的治疗效果。结论:(1)改良DC提取方法,获得CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源耐受性DC纯度均85%;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC对病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均具有较好的治疗效果;(3)利用IVIS成像系统动态观察DiR荧光染料标记CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC经尾静脉输入CIA大鼠体内后,广泛分布于肺脏、脾脏、淋巴结等组织,持续至第35天仍可检测到荧光信号,初步判断微嵌合状态形成。血清细胞因子水平检测结果显示微嵌合状态形成的同时,体内细胞因子格局由Th1向Th2方向偏移,有利于免疫耐受的形成。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22
【图文】：

吉姆萨染色,来源,活细胞率,台盼蓝染色

８天）（集落）；Ｅ表示ＣＩＡ雌性大鼠来源ｃｏｎｔｒｏｌ邋（第８天）（树突状突起）；Ｆ表示Ｃ１Ａ大逡逑鼠来源邋ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ。逡逑图２－丨（’丨Ａ雌性大鼠来源丨）（’倒置显微镜结果（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ（２０（）ｘ）逡逑ｃ？邋ｍｉ逡逑Ａ逦Ｒ邋—逡逑注：Ａ表示Ｃｏｎｔｒｏｌ组ＤＣ；邋Ｂ表示Ｄｅｃｏｙ组ＤＣ。逡逑图２－２邋ＣＩＡ雌性大鼠ＤＣ吉姆萨染色结果（１０（）ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ邋（邋１邋（）0ｘ邋）逡逑２．２邋ＣＩＡ雌性ＳＤ大鼠和正常雄性ＳＤ大鼠来源ＤＣ细胞活性检测逡逑２．２．１台盼蓝染色检测活细胞率逡逑图八，Ｂ为刚提取出的单个核细胞，图Ｃ，Ｄ为培养至第８天的ＤＣ，重复实验逡逑台盼蓝染色结果显示活细胞率均在９４％左右（见图２－３Ａ－Ｄ）。图Ｅ，Ｆ为ＤｉＲ荧逡逑光染料标记前，Ｇ，Ｈ为ＤｉＲ荧光染料标记后，标记前后台盼蓝染色结果显示活逡逑细胞率均在９５％左右（见图Ｅ－Ｈ）。逡逑本文受国家白然科学？金地区科学

台盼蓝染色,来源

荧光染料,来源,雄性大鼠,台盼蓝染色

核细胞；Ｃ，Ｄ表示培养第８天ＤＣ；邋Ｅ，Ｆ为ＤｉＲ荧光染料标记前；Ｇ，Ｈ为ＤｉＲ荧光染料标记逡逑后。逡逑图２－３邋ＤＣ台盼蓝染色观察（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｉ＇ｈｃ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋（２０0ｘ）逡逑２．２．２邋ＭＴＴ检测ＤｉＲ焚光染料标记ＣＩＡ雌性大鼠和正常雄性大鼠来源ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ逡逑ＤＣ后细胞活性结果逡逑（１）邋ＤｉＫ荧光染料标记ＣＩＡ雌性大鼠来源的ＢｌＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ活性检测结果逡逑①

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