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ILC2在RSV感染影响哮喘发生发展中的作用及其机制研究

发布时间:2020-08-25 18:51
【摘要】:目的:支气管哮喘(简称哮喘)是一种由多种细胞包括嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞以及多种细胞组分共同参与的,以气道慢性炎症、粘液分泌增加、气道反应性增高及气道重塑为主要特征的慢性呼吸道疾病。作为一种常见的慢性病,哮喘的发病率呈逐年上升趋势,严重威胁人类健康,已成为严重的全球公共卫生问题。研究哮喘的发病机制,预防和控制哮喘变态反应性炎症的发生和发展,受到越来越多研究者的关注。哮喘的发病机制尚未完全明确,大量的研究认为Th1/Th2免疫失衡是哮喘发病的基础,而在哮喘的发病和发作中细胞免疫和体液免疫均参与其中。呼吸道病毒感染可以影响Th1/Th2平衡,从而在哮喘形成和发展中发挥重要作用,是诱发哮喘及导致哮喘加重的重要因素。其中,导致婴幼儿下呼吸道感染的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起哮喘的重要原因之一。有研究表明由于RSV感染引发支气管炎的儿童,其以后发生反复喘息和哮喘的风险较其他儿童更高,其原因与RSV感染诱导Th2型细胞因子分泌有关。然而也有相反报道证实初次RSV感染可在BALB/c小鼠体内诱导较强的Th1型细胞因子IFN-γ产生,从而下调Th2型免疫应答,抑制病毒复制,减轻气道炎症反应。近来还有研究发现RSV可以通过诱导角化细胞源性细胞因子的生成,下调OVA致敏哮喘小鼠的气道高反应性。我们以往的研究亦显示致敏前RSV感染可以减少肺组织中γδT细胞的数量,下调γδT细胞内Th2型细胞因子IL-4和IL-10mRNA表达并增加Th1型细胞因子IFN-γmRNA表达。RSV感染对哮喘的影响究竟如何,目前尚未十分明确。2型固有淋巴细胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2)是近年发现的一种固有免疫细胞,属于固有淋巴细胞家族,是一类具有淋巴细胞典型形态,但是缺乏特异性的抗原识别受体的淋巴细胞。ILC2来源于骨髓中的淋巴样祖细胞,以往也曾被称为自然辅助细胞(Natural helper cells,NHCs),nuocytes以及固有2型辅助细胞(innate type 2 helper cells,Ih2s)。ILC2主要产生Th2型细胞因子如白细胞介素-5(IL-5),IL-9以及IL-13等,其在变态反应应答、寄生虫感染及哮喘中的作用正日益引起人们的关注。ILC2作为机体中Th2型细胞因子的重要来源,在过敏性支气管哮喘等变态反应的发病机制中发挥着重要作用。有研究发现,流感病毒H3N1感染能导致哮喘的特征性体征气道高反应性,而气道高反应性的产生并不依赖于适应性免疫应答,却依赖于ILC2产生的IL-13,从而证实了固有免疫应答在病毒诱发的哮喘中的作用,揭示了病毒感染诱导哮喘的新机制,即固有免疫细胞来源的IL-13的核心作用。新近的研究也证实OVA诱导的小鼠急性哮喘模型肺组织中的ILC2是OVA诱导的急性哮喘中IL-5和IL-13的重要来源。如前所述,ILC2在OVA诱导的小鼠急性哮喘模型中发挥着重要作用,RSV感染影响哮喘发生发展是否有固有免疫细胞ILC2的参与,其作用及机制如何,目前尚不清楚。故本研究利用感染RSV的OVA哮喘模型鼠,通过检测小鼠肺组织中ILC2的生物活性改变,探讨ILC2在RSV感染影响哮喘发生发展中的作用及其机制,为哮喘的预防和治疗提供理论依据和实验佐证。研究方法:1、病毒的繁殖与滴定Hep-2细胞增殖人类呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2),30%蔗糖超速离心法分离纯化病毒粒子,-80℃冰箱保存备用。病毒滴度采用组织细胞半数感染量(50%Tissue culture infection dose,TCID50)表示。2、动物模型的建立和分组6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,随机分为4组:正常对照组(MOCK组)、RSV感染组(RSV组)、OVA哮喘组(OVA组)及RSV感染哮喘组(RSV/OVA组)。OVA组于第0天和第12天腹腔注射OVA 20μg致敏(含20μg OVA和氢氧化铝2.25mg,溶于100μL PBS),第19-24天将小鼠置于透明密闭容器中以1%OVA溶液雾化吸入激发,每次20 min,1次/天。MOCK组采用相同剂量的PBS致敏和激发。在RSV/OVA组中,OVA初次致敏前一周鼻腔滴入20μL含1.0×10~6 TCID50RSV的悬液感染小鼠。末次雾化吸入后48小时,收集标本。RSV组经含1.0×10~6TCID50RSV悬液滴鼻感染后7天收集标本。3、RSV感染对OVA哮喘鼠气道炎症的影响(1)肺组织病理标本制作及染色:取模型鼠左肺下叶,制备石蜡切片,HE染色,观察肺组织炎症浸润及其它病理学变化。PAS染色观察肺组织杯状细胞增生和粘液分泌情况。(2)瑞氏吉姆萨染色检测BALF炎性细胞类型及数量用1mlPBS冲洗模型鼠肺泡,收集肺泡灌洗液,离心后重悬细胞沉淀,计数细胞总数并制作涂片,瑞氏吉姆萨染色后显微镜下随机选择视野,计数200个细胞,依据细胞形态学特点分别计数中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量及其百分比。(3)ELISA法检测BALF中Th1/Th2型细胞因子水平应用ELISA检测试剂盒,检测模型鼠肺泡灌洗液中Th2型细胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)及Th1型细胞因子(IFN-γ)的含量。(4)实时定量PCR法检测模型鼠肺组织中Th1/Th2型细胞因子mRNA表达水平提取模型鼠肺组织总RNA,逆转录合成cDNA,采用实时定量荧光PCR技术检测肺组织局部Th2型细胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)及Th1型细胞因子(IFN-γ)的mRNA表达水平。4、RSV感染对OVA哮喘鼠ILC2数量及生物学活性的影响(1)肺组织单细胞悬液制备水合氯醛腹腔注射深度麻醉小鼠后提取模型鼠肺组织,剪碎,在含有200μg/ml胶原酶D和40μg/mlDNaseⅠ的培养液中震荡消化,300目钢网过滤收集肺组织单细胞悬液,红细胞裂解液裂解红细胞,计数后悬浮于RPMI1640培养液中。(2)流式细胞术检测肺组织中ILC2数量定量细胞浓度,将细胞数量调整为1×10~6。使用纯化的FcII/III受体的抗体(CD16/32)阻断Fc受体,消除非特异性的结合染色。将细胞重悬于100μL PBS溶液中,实验组加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体FITC-lineage cocktail、APC-anti-Mouse CD45及Percp-anti-Mouse ST2,对照组加入同样荧光标记的非特异性同型抗体,4℃避光反应15min,以含2%胎牛血清的冰PBS液洗涤2次,细胞最后用300μL含2%胎牛血清的PBS重悬,用流式细胞仪进行检测。(3)流式细胞仪检测ILC2细胞内IL-5、IL-13及IL-4等细胞分子表达情况取上述实验制备的细胞悬液,将其与刺激剂50ng/ml的PMA,500ng/ml ionomycin,和10μg/ml brefeldin A充分混匀,放置在37℃培养箱内孵育5h。1ml2%FBS-PBS清洗两遍,离心弃上清,加入荧光抗体FITC-lineage cocktail,APC-anti-Mouse CD45及Percp-anti-Mouse ST2,标记ILC2细胞。加透膜液,重悬细胞,4℃孵育1h,加透膜洗液,清洗一次。4℃条件下1500rpm离心6min,弃上清。1ml PBS重悬,加入PE-anti-Mouse IL-5,PE-anti-Mouse IL-13,PE-anti-Mouse IL-4荧光抗体及isotype controls,避光冰浴30min,2%FBS-PBS 300μl重悬细胞,上流式细胞仪进行检测。(4)实时定量RT-PCR检测ILC2细胞IL-5,IL-13及IL-4 mRNA表达流式分选模型鼠肺组织ILC2细胞,利用Triozl试剂,提取总RNA。采用实时定量PCR方法检测ILC2细胞中IL-5、IL-13及IL-4 mRNA表达。5、过继性回输ILC2对RSV/OVA模型鼠肺部炎症的影响首次雾化前1h尾静脉回输2×10~4个/只ILC2细胞,于末次雾化后48h测定过继性回输ILC2后模型鼠气道炎性细胞浸润及肺部炎症病理改变等相关指标。6、致敏前RSV感染对OVA哮喘鼠IL-33/ST2信号通路的影响采用实时定量荧光PCR技术检测肺组织局部细胞因子IL-33及ST2L mRNA表达水平。7、IL-33/ST2信号通路对肺组织ILC2数量及活性的影响流式细胞仪检测IL-33诱导后小鼠肺组织ILC2总数及分泌Th2型细胞因子的ILC2细胞数量。荧光定量PCR检测封闭抗体阻断ST2后ILC2细胞内IL-4,IL-5及IL-13 mRNA表达情况。8、IL-33对ILC2细胞内信号通路蛋白mRNA表达的影响为探讨IL-33在小鼠肺组织ILC2细胞增殖和活化过程中是否依赖MAPKs及NF-κB信号途径,采用实时荧光定量PCR检测经IL-33诱导后小鼠肺组织ILC2细胞内ERK-1、ERK-2、IRAK-1、IRAK-4、TRAF-6、JNK-1、JNK-2、NF-kB、P38及MyD88 mRNA表达情况。9、统计学处理全部数据采用SPSSl6.0统计学软件进行分析,统计结果表示为±S,采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当差异有统计学意义时,根据Levene法方差齐性检验结果使用Bonferroni或Games-Howell法进行组间比较,P0.05具有统计学意义。结果:1、RSV感染减轻哮喘鼠气道炎症反应,降低哮喘鼠肺组织内炎症细胞数量。经OVA致敏和激发的BALB/c鼠气道上皮增厚、管腔狭窄、肺组织内炎性细胞总数和嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞数量明显增加。致敏前感染RSV可以抑制OVA诱导的肺炎症反应,减轻模型鼠肺组织内炎性细胞浸润。2、RSV感染影响哮喘鼠肺泡灌洗液中Thl/Th2型细胞因子含量致敏前RSV感染明显下调哮喘鼠肺泡灌洗液中IL-5及IL-13的含量,但增加了肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。3、RSV感染影响哮喘鼠肺组织Thl/Th2型细胞因子mRNA表达致敏前RSV感染明显抑制哮喘鼠肺组织细胞IL-4,IL-5及IL-13 mRNA的表达,但增强肺局部IFN-γmRNA表达水平。4、RSV感染降低哮喘鼠肺组织内ILC2细胞总数及分泌Th2型细胞因子的ILC2细胞数量致敏前感染RSV显著降低哮喘鼠肺组织内ILC2细胞总数,分泌IL-4,IL-5和IL-13的活化ILC2细胞数亦因RSV感染而明显下降。5、致敏前RSV感染影响哮喘鼠肺组织ILC2细胞中Th2型细胞因子mRNA表达.致敏前RSV感染明显抑制哮喘鼠肺组织ILC2细胞IL-4、IL-5及IL-13 mRNA的表达6、ILC2细胞参与RSV感染对哮喘鼠气道变态炎症的影响作用RSV/OVA小鼠回输了ILC2细胞后,肺炎性细胞数量明显上升,其中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比增加明显。肺泡灌洗液中Th2型细胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)含量升高,肺组织中Th2型细胞因子(IL-5,IL-13,IL-4)mRNA表达增强,而Th1型细胞因子IFN-γ在肺泡灌洗液中的含量下降,肺组织中mRNA表达减弱,证实ILC2细胞参与RSV感染对哮喘鼠气道变态炎症的影响作用。7、RSV感染降低哮喘鼠肺组织IL-33/ST2L mRNA的表达在本研究中我们利用实时定量荧光PCR技术分析了小鼠肺组织IL-33和ST2LmRNA表达情况,结果显示,与OVA组相比,RSV/OVA组小鼠肺组织IL-33和ST2LmRNA表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。8、IL-33/ST2信号通路诱导BALB/c鼠肺组织ILC2的活化为进一步证实IL-33/ST2信号通路在小鼠肺组织ILC2细胞增殖和活化中的作用,采用流式细胞术检测IL-33诱导后小鼠肺组织ILC2数量及分泌Th2型细胞因子的情况,结果显示IL-33显著增加了肺组织中ILC2数量,并上调了分泌IL-5及IL-13的ILC2数量,对ILC2细胞具有一定的激活作用。而阻断ST2受体可以抑制ILC2细胞内IL-4、IL-5及IL-13的mRNA表达。9、IL-33活化ILC2细胞依赖MAPKs信号通路IL-33可以增加ILC2细胞内MAPK信号途径MyD88、IRAK-4及P38信号因子mRNA表达。结论:1、致敏前RSV感染可以降低过敏原诱发的气道炎症反应。2、致敏前RSV感染通过下调IL-33/ST2信号通路改变ILC2细胞数量及其细胞因子分泌活性,左右气道变态炎症反应过程。3、IL-33对ILC2细胞活化作用依赖于MAPKs信号途径。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R562.25
【图文】:

哮喘,致敏,细支气管,小鼠


1 致敏前 RSV 感染减少哮喘鼠肺组织炎性细胞浸润如图所示,MOCK 组小鼠肺组织细支气管和肺泡结构清晰完整,细支气管整齐,管腔圆整。周围血管和支气管偶见极少量炎性细胞,但未见嗜酸性无明显炎症反应,气管平滑肌及基底层无增厚,基底膜较薄,周围组织无水RSV 组小鼠肺泡充血、增厚、断裂;细支气管及伴行血管周围有少量炎性,主要是淋巴细胞及中性粒细胞;肺炎症反应较 OVA 哮喘组轻。OVA 组小鼠支气管管壁增厚、管腔狭窄,细支气管及伴行血管周围可见以细胞、淋巴细胞为主的大量炎症细胞浸润,支气管粘膜皱壁减少,管腔内栓,杯状细胞增生,肺泡间隔不同程度增宽,部分断裂,形成肺气肿。RSV/OVA 组小鼠气道上皮增厚,管腔明显狭窄,细支气管壁及其周围大量胞浸润,肺炎症反应较 RSV 组更重,但较 OVA 组有所减轻。MOCKRSV

哮喘,杯状细胞,致敏,黏液


大量杯状细胞增生及黏液分泌,AB-PAS 染色胞浆呈紫红色,而经 RSV 感染后,杯状细胞增生减轻、黏蛋白分泌减少。图3.2 致敏前RSV感染减轻OVA哮喘鼠气道杯状细胞黏液蛋白的分泌(×200)图中MOCK代表正常对照组,RSV代表单纯RSV感染组,OVA代表OVA哮喘组,RSV/OVA代表 OVA 致敏前感染 RSV 的 RSV 感染哮喘组,采用 PAS 染色观察肺组织杯状细胞增生和黏液蛋白分泌。3.3 致敏前 RSV 感染降低哮喘鼠肺组织炎症细胞数量小鼠肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数结果如下(图 3.3):细胞总数:与 MOCK 组相比,RSV 组、OVA 组及 RSV/OVA 组小鼠 BALF 中细胞总数均有不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.05)。其中RSV组、RSV/OVA组细胞总数升高幅度小于 OVA 组,与 OVA 组比较

细胞因子,哮喘,统计学意义,致敏


IFN-γ:与 MOCK 组相比,RSV 组及 RSV/OVA 组 IFN-γ 水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。OVA 组 IFN-γ 水平与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与RSV 组及RSV/OVA组相比,差异有统计学意义(P<0.05()图3.4D)。3.5 致敏前 RSV 感染影响哮喘鼠肺组织 Th1/Th2 型细胞因子 mRNA 表达通过实时定量荧光 PCR 检测肺组织 Th1/Th2 型细胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 以及 IFN-γmRNA 表达,结果显示:相较于 MOCK 组,OVA 组及 RSV/OVA 组肺组织 IL-4,IL-5 及 IL-13 mRNA表达水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),证实 OVA 哮喘是以 Th2 型免疫反应为主的气道炎症疾病。其中 OVA 组肺组织 IL-4,IL-5 及 IL-13 mRNA 表达水平均高于 RSV/OVA 组,差异有统计学意义(P<0.05)。RSV 感染可以使小鼠肺组织 Th1 型细胞因子 IFN-γ 表达增强

【参考文献】

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本文编号:2804067

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