2型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与免疫病理机制研究

发布时间：2020-09-01 09:36

　　研究目的:目前公认2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种慢性炎症性疾病,在患者外周血及动物模型的肝脏、脂肪、胰腺等组织中均可检测到明确的炎症反应,炎性细胞因子的分泌增多加重了 T2DM及其并发症的发生发展。免疫系统异常在T2DM慢性炎症过程中扮演了重要角色,淋巴细胞活化信号分子家族(signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF)被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并影响免疫细胞分化及功能。然而对T2DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T2DM和炎症反应发生的具体机制仍不明确。为探讨这一问题,本课题以T2DM患者和人源化小鼠高脂模型为研究对象,通过对T2DM患者外周血中免疫细胞分化及SLAMF分子表达情况进行分析、体外棕榈酸条件下进行细胞实验及人源化高脂模型的建立,以期探讨免疫系统分化及SLAMF分子表达对T2DM慢性炎症反应的作用及其相关机制。研究方法:(1)利用流式细胞分析法对T2DM患者及健康对照组(health control,HC)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞和NK细胞表面SLAMF分子的表达情况:(2)利用流式细胞分析法对T2DM患者外周血中T细胞表达SLAMF3分子及促炎性细胞因子IFN-y和IL-17的表达情况进行检测,分析SLAMF3分子与细胞因子表达之间的相关性;(3)采用流式细胞分选技术将SLAMF3high CD4 T细胞和SLAMF3low CD4 T细胞分别进行分选,在不同浓度抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,观察两种细胞扩增情况;(4)应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD4+T细胞,在体外给予不同浓度棕榈酸,在抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行培养,检测作用72h后CD4+T细胞表面SLAMF3分子表达情况,并将培养后的CD4+T细胞进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;(5)体外培养T细胞系Jurkat细胞,给予不同浓度棕榈酸,作用72h后检测其表面SLAMF3分子表达情况,棕榈酸作用体外培养Jurkat细胞的同时,给予细胞不同浓度的PI3K抑制剂(LY294002)或不同浓度的STAT5抑制剂(sc-355979),检测作用72h后Jurkat细胞表达SLAMF3分子情况;(6)将人胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞转输给经过1.75Gy辐照的NCG小鼠,同时对NCG小鼠进行肾被膜下胸腺组织移植,构建人源化小鼠模型,在该小鼠模型基础上进行高脂饮食喂养,构建人源化小鼠高脂模型。人源化构建成功后5周对人源化小鼠分组进行高脂饮食喂养或正常饮食喂养,每周对小鼠进行体重、随机血糖监测,每3周进行人源化构建比例检测,于高脂饮食喂养后12周对小鼠进行处死。采用血脂检测试剂盒进行血脂检测,用流式细胞分析法检测两组小鼠外周血、肝脏、脾脏、骨髓、胸腺及内脏脂肪组织中免疫细胞重建情况及T细胞表面SLAMF3分子表达情况。对小鼠肝脏、脾脏、胰腺及内脏脂肪组织留取病理,进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosi,HE)染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况及脂肪细胞浸润情况。研究结果:(1)T2DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4T细胞比例增多、CD8T细胞比例减少、NKT细胞比例减少,总NK细胞比例减低、其中主要表现为CD56dimNK细胞比例减低。(2)与HCs相比,T2DM患者外周血PBMC中SLAMF3分子MFI在总T细胞、CD4+T细胞、CD4T细胞及NKT细胞中明显升高;SLAMF5+CD4T细胞及SLAMF5+NKT细胞比例有所升高;SLAMF7分子MFI水平在NKT细胞中明显降低。与HCs相比,T2DM患者NK细胞表面SLAMF3 MFI水平较HCs有所升高;T2DM患者总NK细胞或CD56dimNK细胞表达SLAMF5+细胞比例明显增多;总NK细胞或CD56dimNK细胞中SLAMF6+细胞表达有所下降;总NK细胞或CD56dim NK细胞表面SLAMF7分子明显高表达。(3)T2DM患者T细胞表面SLAMF3分子表达升高与促炎因子IFN-γ和IL-17的产生增多有关,且SLAMF3high CD4 T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增。(4)棕榈酸可通过STAT5-PI3K/Akt通路诱导T细胞表面SLAMF3分子表达升高,棕榈酸诱导的人CD4 T细胞的mRNA测序差异表达基因在T2DM及其并发症的富集明显增多;(5)通过转输人胚胎肝脏CD34+造血干细胞、肾被膜下移植胸腺组织给NCG小鼠,联合高脂饮食喂养,可以建立人源化高脂动物模型,高脂喂养后12周其血清中胆固醇和甘油三酯明显升高、内脏脂肪重量明显增加,但肝脏、脾脏等未见明显脂肪变性或炎细胞浸润情况。流式结果提示高脂喂养组小鼠外周血和VAT中T细胞表面SLAMF3表达水平明显增高。研究结论:(1)T2DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,T细胞及NK细胞表面多种SLAMF分子表达水平不同。(2)T2DM患者T细胞表面SLAMF3分子表达升高与促炎因子IFN-γ和IL-17的产生增多及T细胞扩增状态相关。(3)棕榈酸可通过活化STAT5-PI3K/Akt通路导致T细胞表面SLAMF3分子表达升高,棕榈酸诱导的人CD4 T细胞的mRNA测序差异表达基因在T2DM及其并发症的富集明显增多。(4)通过转输人胚胎肝脏CD34+造血干细胞、肾被膜下移植胸腺组织给NCG小鼠,联合高脂饮食喂养,可以建立人源化高脂动物模型,高脂可能是人源化小鼠外周血和VAT中T细胞表面SLAMF3表达水平升高的主要原因。综上所述,本课题为T2DM慢性炎症反应的发生机制提供了实验证据,证实了饱和脂肪酸如棕榈酸对T细胞表面SLAMF3表达的影响可能导致了炎症反应的发生,提示改变T2DM患者T细胞表面SLAMF3表达水平或可作为T2DM的免疫治疗提供了可能的新靶点。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

免疫系统,细胞因子,患者,获得性免疫

。组织发生慢性炎症过程中会出现天然免疫系统及获得性免疫系统因子的异常分逡逑化，而这些异常分化可能是导致Ｔ２ＤＭ发生的关键因素［３】。肥胖或Ｔ２ＤＭ过程逡逑中会出现许多免疫系统及其细胞因子的异常分泌（图２．１），然而Ｔ２ＤＭ慢性炎逡逑症的发生与免疫异常的相关机制仍不明确。逡逑

棕榈酸,胰岛素抵抗,神经酰胺,信号通路

证明棕榈酸通过ＴＬＲ４介导的ＮＫ－ｋＢ炎症通路的活化引起了血管内皮炎症反逡逑应，从而与心脏冠状动脉疾病的发病相关［１Ｇ４］。棕榈酸可以通过多种代谢途径从逡逑而影响胰岛素信号通路导致胰岛素抵抗的发生（图２．２）。首先，增加的棕榈酸逡逑发挥脂毒性，使甘油二酯（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＤＡＧ）和神经酰胺的水平增加，ＤＡＧ逡逑的增加使蛋白激酶Ｃ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋Ｃ，ＰＫＣ）活化，从而通过磷酸化丝氨酸残逡逑基上的胰岛素受体底物（ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，邋ＩＲＳ）邋－１和活化ＮＫ－ｋＢ通路逡逑影响胰岛素代谢通路［１Ｑ５］。其次，棕榈酸的积聚损伤了线粒体和内质网的功能，逡逑导致内质网应激，从而促进ＮＦ－ｋＢ通路的活化以及活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ逡逑ｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ）产物的增多，进一步加重胰岛素抵抗和炎症反应。与此同时，棕逡逑梢酸可以通过激活膜表面受体（如Ｔｏｌｌ样受体４，邋Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋４，邋ＴＬＲ４）

统计图,亚群,患者,外周血

统计图及流式图（Ｅ）邋＊＊，Ｐ＜０．０１；ｎｓ，无显著差异。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｔｈｅ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ邋（Ｂ，邋Ｃ，邋Ｄ）邋ｉｎ逡逑ＰＢＭＣ邋ｉｎ邋ＨＣｓ邋ａｎｄ邋Ｔ２ＤＭ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｐｒｏｆｉｌｅｓ邋ｏｆ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ邋（Ｅ）．邋＊＊，邋Ｐ＜０．０１，邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．逡逑ＮＫ细胞在Ｔ２ＤＭ患者外周血中同样存在表达异常。通过分析ＮＫ细胞在逡逑外周血中所占比例，可得出，Ｔ２ＤＭ患者外周血中ＣＤ５６＋总ＮＫ细胞表达明显逡逑下降（图３．２Ａ，Ｃ），且主要表现为ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ细胞亚群比例的减低（图３．２Ｂ，逡逑Ｃ）0逡逑Ａ逦Ｂ逦0邋ｈｃ逡逑１５０－，逦0邋Ｔ２ＤＭ逡逑４0ｎ逦逦逦逡逑＊逡逑（Ａ逦逦逡逑ｊｎ邋３０＇逦0逦｜邋１００－逦．逦＾逦＾逡逑１２0．邋ｗ邋。。邋ｉ邋ｒｒ。。雾邋１逡逑

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