类风湿关节炎患者外周血单个核细胞circRNA表达谱差异研究

发布时间：2020-09-09 08:36

　　目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节肿胀及关节压痛为特征的慢性全身性自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。环状RNA(circular RNA,circRNA)是指缺乏5,末端和3,末端的共价闭合环状新型非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),研究表明circRNA不仅可作为多种疾病早期诊断和预后判断的生物学标志物,还可进一步参与疾病发生发展过程。本研究旨在借助高通量测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)分析RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中circRNA及mRNA表达谱差异,并结合生物信息学分析差异表达基因,多样本临床验证并筛选出可作为RA辅助诊断的circRNA分子标志物,进而为RA发病机制的研究奠定基础。方法临床采集4例重症RA患者(RA组)和3例健康对照者(NC组)的空腹外周血各5ml,EDTA-K_2抗凝,利用人外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离出PBMCs,冷冻保存并送至上海烈冰生物医药科技有限公司,其使用VAHTSTM Total RNA-seq(H/M/R)构建RNA样本的cDNA文库,cDNA文库在IIIumina HiSeq TM2500上进行配对测序,检测与NC组相比,RA组PBMCs中差异表达的circRNA和mRNA。对差异表达的circRNA进行基于GO(Gene ontology)数据库的GO显著性富集分析;对差异表达的mRNA进行基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)数据库的KEGG Pathway显著性富集分析。以明显失调的circRNA为中心构建circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络图,展现它们之间的相互作用。从显著差异表达的circRNA中选择2条上调circRNA和2条下调circRNA,使用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)在32例RA患者和20例健康对照者中进行临床验证。受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析已验证显著差异表达的circRNA对RA的检验效能。利用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)对目标circRNA hsa_circ_0000396进行定位分析。流式细胞术分选和qRT-PCR技术分析与健康对照者相比,RA患者CD3~+T、CD19~+B及CD56~+NK细胞中hsa_circ_0000396的相对频率。结果RNA-seq结果显示,RA组和NC组中共有71种显著差异表达的circRNA,包括41种表达上调circRNA和30种表达下调circRNA;RA组和NC组中共有1078种显著差异表达的mRNA,包括662种表达上调mRNA和416种表达下调mRNA。GO富集分析表明,差异表达的circRNA涉及的生物过程变化主要针对NOD2信号通路等;涉及的分子功能变化则主要集中在对poly(A)核糖核酸酶的活性调控过程;细胞组成分析显示差异表达的circRNA大多参与细胞质、线粒体外膜胞质等的组成。KEGG pathway分析表明,差异表达的mRNA主要富集在TNF信号通路和NF-kappaB信号通路。CircRNA-miRNA-mRNA分子调控网络图显示差异表达的circRNA可通过与miRNA相互作用发挥调控下游靶基因作用。qRT-PCR验证结果显示hsa_circ_0000396和hsa_circ_0130438在RA组PBMCs中的表达水平显著低于NC组(P0.05),与测序结果一致;但hsa_circ_0004442和hsa_circ_0025887在RA组的表达量与NC组相比则无明显差异(P0.05)。对hsa_circ_0000396和hsa_circ_0130438进行ROC曲线分析,结果显示,hsa_circ_0000396曲线下面积为0.809,hsa_circ_0130438曲线下面积为0.774,故hsa_circ_0000396对RA诊断具有较高的检验效能,更有潜力成为RA诊断分子标志物。故我们选择hsa_circ_0000396作为目标circRNA进行深入研究,荧光原位杂交技术显示与大多数的外显子circRNA一致,hsa_circ_0000396呈现很强的细胞浆定位。qRT-PCR结果显示,与NC组相比,RA组CD3~+T细胞和CD19~+B细胞中hsa_circ_0000396的表达量明显下降,而两组CD56~+NK细胞中hsa_circ_0000396的表达量则无明显差异。结论证实了RA患者PBMCs中存在显著差异表达的circRNA和mRNA,这些差异表达基因涉及的通路多与炎症和转录活性有关。揭示了hsa_circ_0000396有望成为RA诊断的生物标志物,并可能参与T、B细胞对RA的调控作用,进而为RA诊断治疗及发病机制的研究提供新的方向。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

分层聚类,火山,红色

图 1 显著差异表达 circRNA 分层聚类图ig.1 The hierarchical clustering of significantly dysregulated circRN3 代表 3 例健康对照者，RA-1、RA-2、RA-3、RA-C 代表析图 2 所示的火山图显示了 RA 组和 NC 组差异表达或≤-1.0，且 FDR≤0.05 之间的部分是具有统计学差异示表达下调的 circRNA，右侧红色点表示表达上调的

火山,差异表达,来源不明,条染

图 2 火山图显示 RA 组和 NC 组差异表达 circRNAs were constructed to demonstrate the significantly dysregulated cRA patients注：FC: fold change; FDR: false discovery rate.果中差异表达的 circRNA 大多来源于外显子，仅有两 3 个 circRNA 来源不明，这与之前的研究报道一致。分布于每条染色体，在我们检测出的差异表达的 ci数目的 circRNA，占比约为 11.1%（图 3）。

情况,差异表达,来源不明,条染

图 2 火山图显示 RA 组和 NC 组差异表达 circRNA Volcano plots were constructed to demonstrate the significantly dysregulated circRNA expresRA patients注：FC: fold change; FDR: false discovery rate.在我们的结果中差异表达的 circRNA 大多来源于外显子，仅有两个 circRNA含子，还有 3 个 circRNA 来源不明，这与之前的研究报道一致。且这些差异ircRNA 广泛分布于每条染色体，在我们检测出的差异表达的 circRNA 中，上具有最多数目的 circRNA，占比约为 11.1%（图 3）。

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