SPTBN1抑制原发性骨质疏松及其机制研究
发布时间：2020-09-15 08:22
一、前言老年性和绝经后骨质疏松(原发性骨质疏松)占骨质疏松的85-90%。目前对原发性骨质疏松发病分子机制未完全阐明。全基因组关联性分析(genome-wide association study，GWAS)是基于人的基因组学分析的研究,为骨质疏松症的分子遗传与发病机制研究提供了大量素材,课题组在前期工作中将骨质疏松GWASs数据与转录组学数据结合,筛选出幽灵蛋白家族成员SPTBN1,可能是骨质疏松发生的关键调控分子。SPTBN1是与肌动蛋白交联的骨架蛋白,在癌症、心脏、脑组织等都被证实具有重要的病理生理功能。但其在成骨细胞、破骨细胞、骨血管形成以及骨质疏松症发生中的作用未见报道。因此本文通过在小鼠体内外上调或下调SPTBN1的表达水平,从分子、细胞与整体水平探讨SPTBN1在原发性骨质疏松中的作用及其调控机制,为其治疗提供新靶点。二、目的初步探讨SPTBN1对原发性骨质疏松的影响以及对成骨细胞、骨血管的作用及其调控机制。三、材料与方法1、原发性骨质疏松中SPTBN1表达情况分为老年组(16个月),青年组(3个月),绝经组(去卵巢16周),假手术组,microCT检测其骨微结构,免疫组化检测SPTBN1。2、上调或下调SPTBN1后,原发性骨质疏松小鼠骨微结构、骨内微血管的改变在老年组、绝经组右侧股骨骨髓腔注射沉默SPTBN1的病毒(老年SPTBN1沉默组,绝经SPTBN1沉默组)以下调SPTBN1,或过表达SPTBN1的病毒(老年SPTBN1过表达组,绝经SPTBN1过表达组)以上调SPTBN1,左侧注射对应的阴性对照病毒(老年阴性对照组,绝经阴性对照组),1个月后microCT、HE染色分析骨微结构,或造影剂灌注microCT分析骨内微血管3D图像、血管体积分数和数目的改变。ALP/TRAP染色,免疫组化检测SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn,进行成骨细胞不同分化阶段计数分析。3、SPTBN1对成骨细胞数目和分化功能的影响在前成骨细胞系MC3T3-E1中转染沉默SPTBN1的病毒(SPTBN1沉默组)以下调SPTBN1,或过表达SPTBN1的病毒(SPTBN1过表达组)上调SPTBN1,设立阴性对照组,以及空白对照组,加成骨诱导培养基诱导,CCK8检测法和免疫印迹检测SPTBN1、Cycline E1明确增殖活性,流式细胞术和免疫印迹检测SPTBN1、caspase3明确凋亡情况,ALP和茜素红染色明确细胞的分化功能。4、SPTBN1抑制骨质疏松的可能机制经过以上2的处理,免疫组化检测VEGF。经以上3的处理,免疫印迹检测SPTBN1,Smad3,STAT1,TGF-β,ELISA检测细胞上清液Cxc19的表达水平。四、结果1、老年组比青年组,绝经组比假手术组,SPTBN1表达水平下降。2、老年SPTBN1沉默组比老年阴性对照组,绝经SPTBN1沉默组比绝经阴性对照组骨密度下降,骨小梁数目减少,间隙增宽。其次,SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn表达减少,ALP染色细胞减少,TRAP染色细胞增多。同时骨内微血管体积分数、血管数目减少,VEGF表达下降。3、老年SPTBN1过表达组比老年阴性对照组,绝经SPTBN1过表达组比绝经阴性对照组骨密度升高,骨小梁数目增多。其次,SPTBN1、Runx2、Osx、Ocn表达增多,ALP染色细胞增多,TRAP染色细胞减少。同时骨内微血管体积分数、血管数目增多,VEGF表达增多。4、与阴性对照组、空白对照组对比,SPTBN1沉默组细胞生长缓慢,凋亡增多,ALP和茜素红染色减少。相反,SPTBN1过表达组细胞生长稍加快,凋亡无明显改变,ALP和茜素红染色增多。5、SPTBN1沉默组TGF-β、Cxc19表达增多,STAT1、Smad3磷酸化增多,相反的,SPTBN1过表达组TGF-β、Cxc19表达减少,STAT1、Smad3磷酸化减少。五、结论SPTBN1可促进成骨细胞增殖与分化,并促进骨内微血管生成进而抑制骨质疏松,这一过程可能与其调控VEGF、TGF-β/Smad3、STAT1/Cxc19的表达相关。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R580
【部分图文】：
逑与发展。但这一假说需要通过体内、外研究证实，其作用的分子机制也亟需深逡逑入地探讨（图１－３）。逡逑Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ＢＭＳＣ逡逑（ｉ0３逦Ｎ逦１逡逑＼逦／＼邋！逦＼逡逑＼邋／逦ＳＴＡＴｌ逡逑ＲＵＮＸ＾ＯＳＸ逦、土．邋逦ＶＥＧＦＶＥＧＦＲ逡逑ｉ逦ｉ逡逑Ｃｅｉｌ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋■邋－逦ｊ邋Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ邋卜．逦Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑图邋１－３邋ＳＰＴＢＮ１邋调节骨质疏松的机制假说（ＢＭＳＣ：ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｓｔｒｏｍａ逡逑ｃｅｌｌ；ＶＥＣ：ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ）。逡逑图邋１－３邋Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＳＰＴＢＮ１邋ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ邋ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ逡逑１．４．６邋ＴＧＦ－ｐ／Ｓｍａｄ３信号通路与骨质疏松逡逑转化生长因子－Ｐ邋（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，邋ＴＧＦ－Ｐ）和骨形态发生蛋逡逑白（ｂｏｎｅ邋ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＢＭＰ）信号传导在胚胎骨骨各发育阶段和出生后骨逡逑骼稳态中发挥重要作用［７２］。ＴＧＦ－卩和ＢＭＰｓ结合四聚体受体复合物之后将信号逡逑传导至经典的Ｓｍａｄ依赖性信号传导途径（ｃａｎｏｎｉｃａｌ邋Ｓｍａｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ逡逑ｐａｔｈｗａｙ，即ＴＧＦ＿ｐ／ＢＭＰ配体，受体和Ｓｍａｄｓ）和非Ｓｍａｄ依赖性信号传导途径逡逑（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ－Ｓｍａｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ，邋ＳＰｐ３８丝裂原活化蛋白激酶逡逑／邋ｐ３８邋ＭＡＰＫ
第二章邋ＳＰＴＢＮ１对小鼠骨微结构的影响小电钻轻轻扭转插入胫骨和股骨关节之间的股骨顶部的髁间窝，突破感取出电钻。使用微量注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器，货号７０１邋Ｒ３３Ｇ针头，货号ＮＥＥＤＬＥ－３３邋－邋７８０３－０５）。将３３Ｇ骨髓针全部插入），将病毒（５ｕｌＡＡＶ或８ｕｌＳＡＭ或相应的阴性对照病毒，病毒缓慢注入股骨腔中，并停留ｌＯｍｉｎ。缓慢取出注射器以减少回流行封口。所有小鼠右腿注射阳性病毒，左腿注射阴性对照病毒［１３性骨质疏松阴性对照病毒组（老年阴性对照组），老年性骨质疏病毒组（老年ＳＰＴＢＮ１沉默组），老年性骨质疏松过表达ＳＰＴＢＮＳＰＴＢＮ１过表达组），绝经后骨质疏松阴性对照病毒组（绝经阴经后骨质疏松沉默ＳＰＴＢＮ１病毒组（绝经ＳＰＴＢＮ１沉默组），绝表达ＳＰＴＢＮ１病毒组（绝经ＳＰＴＢＮ１过表达组），如图２－１邋Ａ－Ｂ。逡逑Ａ逡逑
２．３．１．１老年性骨质疏松小鼠模型逡逑自发性老年性骨质疏松小鼠模型（老年组，１６个月）和对照青年组（青年组，逡逑３个月）的股骨进行活体和离体ＣＴ扫描和ＨＥ染色（图２－２）。结果显示老年组逡逑小鼠相较青年组小鼠体型大而肥硕（图２－２Ａ）。老年组比青年组骨密度明显下降，逡逑骨小梁数量明显减少，间隙增宽，结构紊乱，脂肪组织X椂啵夏曜橛泄钦矍沐义舷颍ㄍ煎澹玻玻拢模ｅ义希常峰义
本文编号：2818730
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R580
【部分图文】：
逑与发展。但这一假说需要通过体内、外研究证实，其作用的分子机制也亟需深逡逑入地探讨（图１－３）。逡逑Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ＢＭＳＣ逡逑（ｉ0３逦Ｎ逦１逡逑＼逦／＼邋！逦＼逡逑＼邋／逦ＳＴＡＴｌ逡逑ＲＵＮＸ＾ＯＳＸ逦、土．邋逦ＶＥＧＦＶＥＧＦＲ逡逑ｉ逦ｉ逡逑Ｃｅｉｌ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋■邋－逦ｊ邋Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ邋卜．逦Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑图邋１－３邋ＳＰＴＢＮ１邋调节骨质疏松的机制假说（ＢＭＳＣ：ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｓｔｒｏｍａ逡逑ｃｅｌｌ；ＶＥＣ：ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ）。逡逑图邋１－３邋Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＳＰＴＢＮ１邋ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ邋ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ逡逑１．４．６邋ＴＧＦ－ｐ／Ｓｍａｄ３信号通路与骨质疏松逡逑转化生长因子－Ｐ邋（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，邋ＴＧＦ－Ｐ）和骨形态发生蛋逡逑白（ｂｏｎｅ邋ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＢＭＰ）信号传导在胚胎骨骨各发育阶段和出生后骨逡逑骼稳态中发挥重要作用［７２］。ＴＧＦ－卩和ＢＭＰｓ结合四聚体受体复合物之后将信号逡逑传导至经典的Ｓｍａｄ依赖性信号传导途径（ｃａｎｏｎｉｃａｌ邋Ｓｍａｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ逡逑ｐａｔｈｗａｙ，即ＴＧＦ＿ｐ／ＢＭＰ配体，受体和Ｓｍａｄｓ）和非Ｓｍａｄ依赖性信号传导途径逡逑（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ－Ｓｍａｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ，邋ＳＰｐ３８丝裂原活化蛋白激酶逡逑／邋ｐ３８邋ＭＡＰＫ
第二章邋ＳＰＴＢＮ１对小鼠骨微结构的影响小电钻轻轻扭转插入胫骨和股骨关节之间的股骨顶部的髁间窝，突破感取出电钻。使用微量注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器，货号７０１邋Ｒ３３Ｇ针头，货号ＮＥＥＤＬＥ－３３邋－邋７８０３－０５）。将３３Ｇ骨髓针全部插入），将病毒（５ｕｌＡＡＶ或８ｕｌＳＡＭ或相应的阴性对照病毒，病毒缓慢注入股骨腔中，并停留ｌＯｍｉｎ。缓慢取出注射器以减少回流行封口。所有小鼠右腿注射阳性病毒，左腿注射阴性对照病毒［１３性骨质疏松阴性对照病毒组（老年阴性对照组），老年性骨质疏病毒组（老年ＳＰＴＢＮ１沉默组），老年性骨质疏松过表达ＳＰＴＢＮＳＰＴＢＮ１过表达组），绝经后骨质疏松阴性对照病毒组（绝经阴经后骨质疏松沉默ＳＰＴＢＮ１病毒组（绝经ＳＰＴＢＮ１沉默组），绝表达ＳＰＴＢＮ１病毒组（绝经ＳＰＴＢＮ１过表达组），如图２－１邋Ａ－Ｂ。逡逑Ａ逡逑
２．３．１．１老年性骨质疏松小鼠模型逡逑自发性老年性骨质疏松小鼠模型（老年组，１６个月）和对照青年组（青年组，逡逑３个月）的股骨进行活体和离体ＣＴ扫描和ＨＥ染色（图２－２）。结果显示老年组逡逑小鼠相较青年组小鼠体型大而肥硕（图２－２Ａ）。老年组比青年组骨密度明显下降，逡逑骨小梁数量明显减少，间隙增宽，结构紊乱，脂肪组织X椂啵夏曜橛泄钦矍沐义舷颍ㄍ煎澹玻玻拢模ｅ义希常峰义
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