高脂饮食致大鼠心肌线粒体动力学、线粒体复合酶损伤

发布时间：2020-09-15 11:33

　　研究背景随着人们生活水平的提高,饮食结构发生了重大的变化,逐渐向西方饮食转变。西方饮食(Western Diet),富含高饱和脂肪酸和胆固醇,缺少维生素与膳食纤维。最新的《中国居民营养与健康现状》指出,膳食高能量、高脂肪摄入和缺乏运动与超重、肥胖、糖尿病及血脂异常的发生密切相关。脂肪(FAT)的摄入,尤其是饱和反式脂肪酸,与肥胖,糖尿病和心血管疾病(CVD,Cardiovascular Disease)的风险增加有关[1]。在人体实验中,发现即使是25%-35%的脂肪能量占总热量比,就会引起脂肪组织聚集,尤其在成人中,来自碳水化合物的脂肪新生的比率比较低。这意味着大多数的体内脂质的聚集是来自于饮食[2]。有研究指出,饮食中FA摄入量的增加,将对心脏酯化脂肪酸池的大小和脂肪酸的组成产生影响。随着FA的摄取增加,心肌细胞内TG(甘油三酯)含量也会明显增加。心肌细胞内TG含量被认为是脂毒性的评价指标。尽管如此,心肌内TG含量升高和心功能变化之间的潜在的分子机制知之甚少。不像其他组织细胞,心肌细胞主要依赖FFA(游离脂肪酸)的氧化供能,以生成ATP维持心肌细胞不停地收缩。线粒体在这个过程中起主要作用。然而慢性暴露于过量的脂肪酸又可能导致线粒体功能障碍和心力衰竭。以往的研究多集中在,脂质聚集引起ROS(活性氧)的释放,使线粒体容易受到ROS的损伤而引发线粒体参与的细胞凋亡过程。线粒体的质量控制在维持正常的心脏功能中起着关键作用。线粒体的动力学,包括线粒体分裂和线粒体融合,是心脏的线粒体质量控制的主要调控机制。线粒体动力学不仅是心血管成熟所必须的,而且还与多种CVD密切相关。在CVD中,线粒体的结构和功能都会发生一系列的改变[3]。那么高脂饮食是否能引起线粒体结构与功能障碍呢?是否是高脂饮食致心功能障碍是通过线粒体的动力学途径呢?此类研究报道较少。本课题结合以往的临床实验和流行病学调查,提出问题。高脂饮食会导致心肌脂质聚集,引起心功能障碍。并评价线粒体功能与结构,阐明线粒体动力学在高脂饮食致大鼠心功能障碍的作用。为进一步探讨线粒体动力学障碍促进心血管疾病发生的分子机制,为从改善能量代谢与改善线粒体动力学的角度为临床靶向治疗心功能障碍疾病提供新思路。目的1、高脂饮食是否会引起心脏脂毒性(包括心脏脂质的聚集与心功能评价)。2、在高脂饮食致心功能障碍中线粒体的数目、形态与功能是否发生了变化。3、线粒体动力学是否与心功能障碍有关。研究方法:为了研究高脂饮食对心肌的线粒体功能的影响,40只SD大鼠被随机分为两组,(1)正常饮食组(n = 20)饲料含有10%脂肪,70%碳水化合物,20%蛋白质;(2)高脂饮食组(n = 20)饲料热量为5.24kcal/g,含有60%脂肪,20%碳水化合物,20%蛋白质。造模时间为28周。试验结束后对心肌脂质含量进行测定。运用心脏彩色超声多普勒对两组大鼠心功能进行评估。运用超微透射电镜对线粒体形态进行评估。运用高效液相色谱分析法对大鼠心肌内腺苷酸代谢系统进行评价,线粒体动态学的相关基因测定使用定量聚合酶链反应和免疫印迹法。线粒体蛋白质组学分析用以研究高脂饮食对线粒体蛋白组的影响。结果1.高脂饮食引起大鼠心肌脂质聚集CON组大鼠心包内有少量脂肪,而HFD组大鼠心包内脂肪明显增加,包绕于心尖部及心脏冠脉表面。与CON组(0.33±0.047g)相比,HFD组大鼠PFT重量增加了三倍(0.95±0.102g),差异有统计学意义。(如图2.F)。HFD组大鼠左心室肌内TG含量(45.8 ± 9.3 μmol/μg蛋白)是CON组大鼠心肌内TG含量(21.3 ±6.9 μmol/μg蛋白)的两倍多,差异有统计学意义(P0.05)。与CON组大鼠心肌内FFA含量(0.18±0.04 nmol/μg蛋白)相比,HFD组大鼠心肌内FFA含量(0.26±0.07 nmol/μg蛋白)增加,差异有统计学意义(P0.05)。2.高脂饮食引起大鼠心脏结构与功能改变大体观与组织称重显示:与CON组大鼠相比,HFD组大鼠HM(全心质量,1130±36.84mg vs 1327±25.62 mg,p0.05)增加,LVM(左心质量,943.67±33.29 mg vs 1127.58 ± 30.78 mg,p0.05)增加。用股骨的长度作为校正后,与CON 组相比,HFD 组大鼠 HMI(全心指数,24.77 ± 1.84 mg/mm vs 30.92 ± 1.57 mg/mm)与 LVMI(左心室重量指数,20.49 ± 1.85 mg/mm vs 26.23 ± 2.08 mg/mm)也明显增大(p0.05)。心脏彩色超声多普勒显示:CON组大鼠心脏左室近似椭圆形,室壁厚薄均匀、运动良好,HFD组大鼠心腔扩大,心肌肥厚,运动无力(如图1.C-D)。统计学分析显示,与CON组相比,HFD大鼠室间隔厚度(IVSd,2.16± 0.15 vs 2.48 ± 0.08 mm,P0.05))、收缩末期左室内径(LVIDs,3.18 ± 0.32 vs 3.84 ± 0.52 mm,P0.05)、左室后壁厚度(LVPWd,2.10 ±0.10 vs 2.52 ±0.25mm,P0.05)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWs,2.82 ±0.36 vs 3.30 ± 0.25 mm,P0.05)增加,射血分数(EF,82.7 ± 5.3 vs 73.3 ± 2.0%)、短轴缩短率(FS,46.5 ±5.1 vs 37.3 ± 1.7%,P0.05)明显下降。3.高脂饮食引起大鼠线粒体结构、数目与功能异常超微透射电镜下观察心肌内超微结构显示:CON组大鼠心肌粗肌丝与细肌丝排列规则,肌节正常,Z线清楚,肌纤维束旁含有大量线粒体,多呈现圆形或者椭圆形,线粒体双层膜结构完整,线粒体内崤结构清晰完整,崤密度正常;HFD组大鼠,心肌组织内粗肌丝与细肌丝排列不清楚,肌节显示不清楚,Z线完全消失;线粒体排列无规律,线粒体双层膜结构不完整。部分线粒体长度增大,甚至横跨多个肌节,部分线粒体肿胀明显,线粒体内部嵴稀疏,基质颗粒显著减少,部分线粒体出现崤溶解、断裂,内部出现多个亮区或空泡。部分线粒体呈现碎片化,结构不完整。HFD组大鼠线粒体DNA拷贝数(mtDNA copy number)是CON组mtDNA copy number的39.1 ± 6.1%,P0.05),说明HFD组大鼠心肌内线粒体的数目明显下降。为评价线粒体内氧化磷酸化的效率,我们检测了大鼠左室心肌细胞线粒体内的 Complex Ⅰ、Complex Ⅱ、ComplexⅢ(线粒体复合酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和 CS(柠檬酸复合酶)的活性,结果显示与CON组大鼠相比,HFD组大鼠线粒体内ComplexⅠ(19.5 ± 5.1 nmol/min·mgpro vs 6.2 ± 1.3 nmol/min·mgpro,P0.05)、Complex Ⅱ(21.9 ± 4.1 nmol/min·mgpro vs 13 ± 1.4 nmol/min·mgpro,P0.05)、ComplexⅢ(125.3 ± 5.7 nmol/min·mgpro vs 80.0 ± 8.4nmol/min·mgpro,P0.05),和 CS(371.2±38.5 nmol/min·mgprovs244.0±35.0 nmol/min·mgpro,P0.05)的活性下降,差异具有统计学意义。其中尤以Complex Ⅰ活性下降明显。线粒体复合酶活性下降,氧化磷酸化受损。为检测高脂饮食对大鼠心肌能量代谢的影响,我们用高效液相色谱分析法(HPLC)分析大鼠心肌内ATP(三磷酸腺苷)、ADP(二磷酸腺苷)、AMP(单磷酸腺苷)的含量,并计算AMP/ATP、TAN(总磷酸腺苷)、EC(能荷)。分析结果显示:与CON组相比,HFD大鼠心肌内TAN(5.97±0.34 ug/ml vs 5.11±0.85 ug/ml,P0.05)总量不变,但是 ATP(2.83±0.4 ug/ml vs 1.78±0.45 ug/ml,P0.05)及 ADP(2.50 ± 0.15 ug/ml vs 2.03±0.23 ug/ml,P0.05)含量减少,EC(0.67 ± 0.03 ug/ml vs 0.55 ± 0.05 ug/ml,P0.05)下降;与 CON 组相比,HFD 组 AMP 浓度明显升高(0.78 ± 0.14 ug/ml vs 1.3 ± 0.36 ug/ml,P0.05),AMP/ATP 显著提高(0.26± 0.03 vs 0.75 ±0.04,P0.05)。高脂饮食引起心肌细胞总体能量代谢障碍。对线粒体动力学相关基因mRNA检测显示:与CON组相比,HFD组大鼠,线粒体融合相关基因MFN2 mRNA、OPA1 mRNA,线粒体分裂相关基因FIS1mRNA表达下降。差异有统计学意义(P0.05)。我们提取左心室心肌全蛋白以及左心室的线粒体,对线粒体动力学相关蛋白进行Western Blot显示,与CON组大鼠相比,HFD组大鼠线粒体融合相关基因MFN1、MFN2、OPA1蛋白表达下降,线粒体分裂相关蛋白P-DLP、FIS表达增加、DLP表达不变。并且,显然,在心肌线粒体内,线粒体融合相关蛋白与线粒体分裂相关蛋白的浓度更高,变化更加明显。4.高脂饮食使大鼠线粒体蛋白组学发生了一系列涉及代谢底物、氧化磷酸化相关复合酶、ATP转运蛋白、线粒体动力学的变化:①能量供应底物相关:脂肪酸氧化相关蛋白表达明显下降;葡萄糖有氧氧化及糖酵解相关蛋白表达有升高的趋势;三羧酸循环相关蛋白表达下降。说明代谢底物由游离脂肪酸转变为葡萄糖。底物的变化也是心功能障碍的一个重要的代谢标志。②氧化磷酸化相关蛋白:线粒体呼吸链复合酶I、V的相关亚基表达下降。氧化磷酸化效率下降。③ATP转运相关蛋白亚基表达下降,差异有统计学意义(P0.05)如ADP/ATP转移酶、电子传递黄素蛋白-辅酶Q氧化还原酶、电子转移黄蛋白亚基α等。④线粒体动力学相关蛋白:线粒体融合相关蛋白MFN2(差异有统计学意义,P0.05)表达下降,MFN1、OPA1表达下降(差异无统计学意义,P0.05);线粒体分裂相关蛋白FIS1表达升高(差异有统计学意义,P0.05)。说明线粒体融合减少,分裂增多,出现了线粒体动力学功能紊乱。结论1、28w的高脂饮食增加了大鼠心包内及心肌内的TG含量,使大鼠心肌内FFA的含量增加,高脂组大鼠出现了心肌重构和心功能下降。2、对于心肌线粒体超微结构的观察发现,高脂饮组大鼠心肌内线粒体的形态异常和结构损伤;HFD引起心肌线粒体拷贝数减少;线粒体内复合酶I、复合酶Ⅱ、复合酶Ⅲ、柠檬酸合酶活性下降;在总的腺苷酸不变情况下,HFD组大鼠心肌内ATP含量减少,能逆向转化为ATP的ADP含量减少,AMP含量增多,Energy Charge下降,心肌细胞总体能量代谢障碍。HFD组大鼠出现了心肌细胞线粒体结构和功能障碍。3、HFD导致大鼠心肌线粒体动力学功能紊乱,线粒体的融合与分裂动态平衡被打乱,线粒体质和量难以维持,ATP产生不足,能量耗竭,引起心功能障碍。4、线粒体蛋白组学进行研究,发现在高脂饮食组大鼠中,出现了能量代谢底物的变化,电子传递链相关蛋白下降;同时发现线粒体动力学相关蛋白MFN1、MFN2、OPA1表达下降,FIS1升高。线粒体动力学功能紊乱,线粒体正常的结构与数目难以维持。线粒体功能障碍和线粒体动力学受损在高脂诱导的心脏功能障碍中发挥重要作用,这是一个潜在的心脏疾病的治疗目标。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：

心脏结构,高脂饮食

图１．高脂饮食对大鼠体重及心脏结构的影响逡逑

内脂,高脂饮食,心肌

图２．高脂饮食对大鼠心脏结构以及对心包、心肌内脂质聚集的影响逡逑

线粒体,腺苷酸,复合酶

图３．氋脂饮食对大鼠心肌线粒体超微结构及线粒体腺苷酸线粒体复合酶活性的逡逑影响逡逑

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