JNK信号通路在多聚左旋精氨酸诱导NCI-H292细胞凋亡中的作用及其机制研究

发布时间：2020-09-17 20:35

　　 目的:探讨c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路在多聚左旋精氨(Poly-L-arginine,PLA)诱导NCI-H292细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法:1、细胞培养:NCI-H292细胞生长于10%胎牛血清+100 mg/L青霉素+100 mg/L链霉素+12mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO_2培养箱内培养,每2天换液1次。2、Western Blot法检测JNK信号通路蛋白的表达选择PLA为凋亡诱导物,诱导气道上皮细胞NCI-H292的凋亡。分别以0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L浓度的PLA刺激NCI-H292细胞24小时后提取各组细胞总蛋白,采用Western Blot法检测各组细胞内P-JNK/JNK表达有无差异。3、Annexin V-FITC/PI双染法检测NCI-H292细胞凋亡情况将NCI-H292细胞设为空白对照组、PLA组、SP600125组、PLA+SP600125组,按照分组要求提前1h用特异性JNK通路抑制剂SP600125预处理NCI-H292细胞,然后加入PLA,处理细胞24小时后收集各组细胞,采用Annexin V和PI双染的方法,染色凋亡的NCI-H292细胞,并于4小时内进行流式细胞的检测分析,观察JNK通路抑制剂SP600125(10μM)作用前后细胞的凋亡情况。4、Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3的表达采用Western Blot方法分别检测空白对照组、PLA组、SP600125组、PLA+SP600125组中NCI-H292细胞内Bax、Bcl-2、Casepase-3的表达和信号通路蛋白JNK、P-JNK的表达。5、统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析,结果以均数±标准差表示,多组数据间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);两两间比较当方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Dunnett′s T3检验,P0.05表示差异有统计学意义。结果:1、PLA浓度10 mg/L组作用NCI-H292细胞后JNK磷酸化水平与0mg/L组比较无统计学差异(P=0.179),PLA作用浓度为20 mg/L组、40 mg/L组、60 mg/L组的JNK磷酸化水平与0mg/L组比较均增加,且呈现剂量依赖性,差异有统计学意义(F=4.239,P均0.05)。2、空白对照组、PLA组、SP600125组、PLA+SP600125组NCI-H292细胞凋亡率分别为(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、(5.69±0.18)%、(8.99±1.74)%,各组间差异有统计学意义(F=113.961,P0.001);PLA组NCI-H292细胞凋亡率与空白对照组相比明显增高(P0.001);PLA+SP600125组与PLA组比较细胞凋亡率明显降低(P0.001)。3、PLA(40 mg/L)作用于NCI-H292细胞后,P-JNK/JNK比值与空白对照组相比明显升高(F=31.778,P0.001);凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值降低(F=21.077,P0.01);Caspase-3表达明显升高(F=31.768,P0.001)。4、特异性JNK通路抑制剂SP600125干预后,PLA+SP600125组相比PLA组NCI-H292细胞内P-JNK/JNK比值显著降低(P0.001);Bcl-2/Bax比值显著升高(P0.001);Caspase-3表达显著下降(P0.001)。结论:1、气道上皮NCI-H292细胞内JNK信号转导信号通路能够被PLA激活;2、PLA可以诱导NCI-H292细胞内促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低;3、JNK信号通路能通过促进Bax、Caspase-3表达,抑制Bcl-2表达介导PLA诱导的NCI-H292细胞凋亡。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R562.25
【部分图文】：

图 1 PLA 作用 24 h 后 NCI-H292 细胞内 P-JNK/JNK 的表达“*”代表实验组与 0 mg/L 组比较：*P<0.05.Fig 1: The expression of P-JNK/JNK in NCI-H292 cells by Western blotCompared to controls：*P<0.05.P600125 抑制 PLA 对 NCI-H292 细胞凋亡的诱导作用据前面的研究结果发现PLA可诱导NCI-H292细胞内JNK信号通路的活化，用 10ul 浓度为 20 μmol/L 的 JNK 信号通路的特异性抑制剂 SP600125 预先NCI-H292 细胞 30min，采用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测 SP600125 对 PLANCI-H292 细胞凋亡率的影响。结果显示，空白对照组、PLA 组、SP600125LA+SP600125 组 NCI-H292 细胞凋亡率分别为(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、±0.18)%、(8.99±1.74) %；采用单因素方差分析统计结果，显示各组间差异有

Caspase-3 及 P-JNK/JNK 的表达1.对照组；2.PLA 组；3.PLA+SP600125 组；4.SP600125 组；A：统计分与 Bax 条带灰度值比值；B：统计分析 Caspase-3 与β-actin 条带灰度值比统计分析 P-JNK 与 JNK 条带灰度值比值；与对照组比较：**P<0.01，***P与 PLA 组比较：###P<0.001Fig 3: The expression of Bax, Bcl-2, Caspase-3 and P-JNK / JNK in NCI-H292 Cells inby SP6001251: control group, 2:PLA group, 3:PLA+SP600125 group, 4: SP600125 group; A. The baBcl-2/ Bax. B. The bar chart of Caspase-3/β-actin. C. The bar chart of P-JNK/JNK. Compcontrol group, **P<0.01，***P<0.001, Compared with PLA group, ###P<0.001.5 讨论

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本文编号：2821203