miR-17-5p靶向ANKH调控成纤维细胞在强直性脊柱炎中异位骨化的机制研究

发布时间：2020-09-22 10:50

　　目的:探讨miR-17-5p在正常和强直性脊柱炎(AS)患者关节囊组织中的表达水平差异,进而研究miR-17-5p调控ANKH的表达影响成纤维细胞异位骨化的细胞生物学机制,为强直性脊柱炎疾病探寻新的治疗靶点并提供新的理论依据。方法:本实验开始前,进行伦理审查申请并获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。根据《赫尔辛基宣言》经患者及家属知情同意后,收集由广西医科大学第一附属医院骨科手术切除获得强直性脊柱炎患者髋关节囊组织共20份为实验组,以18份同部位组织为对照组。实验组所有病例诊断符合1984年美国纽约标准,患者无其他异常情况如风湿等;对照组患者既往身体健康,无强直性脊柱炎及类风湿等的异常情况。将组织切片进行BCIP/NBT、茜素红染色,比较两组韧带组织异位骨化差异;利用实时荧光定量PCR检测患者韧带组织中miR-17-5p和ANKH及成骨相关基因mRNA的表达水平,并与对照组的进行比较,确定miR-17-5p和ANKH与强直性脊柱炎的相关性,是否存在负相关关系;利用Western-Blot检测两组韧带组织中ANKH、Runx2、Col1a1蛋白表达水平差异。采用组织块法分离培养成纤维细胞,进行HE、BCIP/NBT、茜素红染色,比较两组细胞形态及矿化成骨差异;利用实时荧光定量PCR检测两组细胞中miR-17-5p和ANKH及成骨相关基因mRNA的表达水平差异;利用Western-Blot检测两组细胞中ANKH、Runx2、Col1a1蛋白表达水平差异。利用TargetScan、Miranda等在线预测软件,分析miR-17-5p与ANKH基因3’UTR上的作用位点。利用分子生物学的方法,克隆得到ANKH基因3’UTR序列,进行生物信息学分析,确定miR-17-5p的结合位点。将ANKH基因3’UTR序列插入到荧光素酶报告基因下游,同时对miR-17-5p结合位点进行序列突变,利用双荧光素酶报告基因实验,验证miR-17-5p通过作用于ANKH基因3’UTR上的结合位点,调控ANKH基因的表达。采用慢病毒介导的调控技术,构建miR-17-5p mimic、miR-17-5p inhibitor和miR-17-5p control慢病毒表达载体,包装慢病毒,感染原代成纤维细胞,可以长期的在细胞内稳定表达miR-17-5p mimic、miR-17-5p inhibitor和miR-17-5pcontrol。检测过表达或抑制miR-17-5p后,ANKH、RUNX2、COL1a1的mRNA及蛋白表达水平的变化,以及钙化结节染色检测成骨分化差异等,在细胞水平进一步证实miR-17-5p直接靶向ANKH并参与钙化的发生。结果采用常用统计软件SPSS 22.0进行分析,P㩳0.05说明差异有统计学意义。结果:AS髋关节囊韧带组织与正常韧带中均含有大量成纤维细胞。BCIP/NBT染色可见AS组明显深染,呈深蓝色,而对照组基本未着色;Alizarin Red染色可见AS组有明显钙化结节,而对照组未见钙化结节;实时荧光定量PCR检测可见miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP在AS标本中mRNA高表达,较对照组明显升高,而ANKH在AS标本中的mRNA低表达,约为对照组的1/3;Western blot检测也表明在AS髋关节韧带中Col1a1、Runx2蛋白表达均高于对照组,而ANKH蛋白表达明显低于对照组;碱性磷酸酶活性检测提示AS组明显高于对照组。成功从AS髋关节囊韧带及对照组韧带中分离培养成纤维细胞,外观形态上二者没有明显差别,但Vimentin染色对照组较AS组明显深染;Alizarin Red染色见AS组成纤维细胞钙化结节明显多于对照组,BCIP/NBT染色见AS组成纤维细胞呈深蓝色,而对照组基本未着色;AS来源的成纤维细胞中miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP的mRNA较对照组明显高表达,ANKH的mRNA低表达,与韧带组织结果一致;AS来源的成纤维细胞中Col1a1、Runx2蛋白较对照组明显高表达,ANKH的蛋白低表达,与韧带组织中蛋白表达结果一致;碱性磷酸酶活性检测提示AS来源的成纤维细胞明显高于对照组,与韧带组织检测结果一致。TargetScan、Miranda等在线预测软件均预测ANKH为miR-17-5p的靶基因,野生型ANKH 3’UTR和突变体ANKH 3’UTR的Luciferase报告基因载体构建及鉴定成功,共转染mi R-17-5p模拟物和p MIR/ANKH报告基因载体后,萤光素酶活性明显降低,而共转染miR-17-5p抑制剂和p MIR/ANKH报告基因载体后,萤光素酶活性变化不大,共转染miR-17-5p模拟物或抑制剂和p MIR/ANKH/mut报告基因载体后则不影响信号强度。慢病毒构建成功后,能有效转染成纤维细胞。上调成纤维细胞中miR-17-5p表达水平后,其ANKH的mRNA及蛋白表达水平明显下降,Col1a1和Runx2的mRNA及蛋白表达上调,而下调成纤维细胞中miR-17-5p表达水平后,其ANKH的mRNA及蛋白表达水平明显上调,Col1a1和Runx2的mRNA及蛋白表达水平下降,碱性磷酸酶活性检测与BCIP/NBT、Alizarin Red染色结果与miR-17-5p水平一致,差异有统计学意义,提示miR-17-5p能抑制ANKH的表达,继而调控成纤维细胞的成骨分化。结论:AS髋关节囊韧带组织较对照组具有明显成骨倾向;miR-17-5p、Col1a1、ALP、Runx2、Bmp2、BGP在AS韧带组织中mRNA较对照组明显高表达,在AS来源的成纤维细胞中亦较对照组明显高表达;Col1a1、Runx2蛋白在AS韧带组织中明显较对照组高表达,同时在AS来源的成纤维细胞中亦明显较对照组高表达;ANKH在AS韧带组织中mRNA及蛋白均较对照组低表达,在AS来源的成纤维细胞中亦较对照组低表达,与miR-17-5p的表达水平负相关;miR-17-5p可负性调控ANKH表达,参与成纤维细胞的成骨分化;上调成纤维细胞的miR-17-5p表达后能够促进成纤维细胞成骨分化,而下调成纤维细胞的miR-17-5p表达后能够抑制成纤维细胞成骨分化,这可能是强直性脊柱炎患者关节周围韧带成纤维细胞异位成骨的一个原因,有可能成为治疗强直性脊柱炎的潜在靶点。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R593.23
【部分图文】：

强直性脊柱炎,关节囊,HE染色,对照组

图 1-1 关节囊组织 HE 染色 Control:对照组,AS: 强直性脊柱炎组Figure 1-1 HE staining of joint capsules酶染色及茜素红染色T 染色（图 1-2）可见强直性脊柱炎组呈深蓝色，而染色(图 1-3)可见强直性脊柱炎组有钙化结节，而成。

强直性脊柱炎,对照组,关节囊,深蓝色

强直性脊柱炎,对照组,深蓝色

酶染色及茜素红染色T 染色（图 1-2）可见强直性脊柱炎组呈深蓝色，而红染色(图 1-3)可见强直性脊柱炎组有钙化结节，而成。图 1-2 BCIP/NBT 染色 Control:对照组,AS: 强直性脊柱炎组Figure 1-2 BCIP/NBT staining

【参考文献】