Sema3A刺激BMSCs膜片对T2DM大鼠新骨形成作用的研究

发布时间：2020-09-22 19:12

　　目的:观察经信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)处理后,2型糖尿病(T2DM)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖、迁移及成骨分化能力是否发生变化。通过构建动物实验模型,探究Sema3A刺激的BMSCs膜片对2型糖尿病大鼠新骨形成的作用。方法:通过高脂高糖持续饲养联合腹腔注射链脲佐菌素构建T2DM大鼠模型,分离和培养其BMSCs;采用RT-qPCR,Western blot比较正常及T2DM大鼠来源的BMSCs细胞Sema3A的表达特性;分别用0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml Sema3A重组蛋白刺激BMSCs,CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验检测其增殖以及迁移能力的改变,RT-qPCR检测成骨相关基因包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen alpha 1 chain,COLⅠ)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein,BMP2)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)和骨钙蛋白(Osteocalcin,Ocn)的表达;ALP染色、天狼星红染色、茜素红染色观察BMSCs成骨分化能力、胶原形成能力和矿化水平的变化。诱导培养2型糖尿病大鼠BMSCs为细胞膜片,使用随机数字表法将构建成模的2型糖尿病大鼠随机分为对照组、膜片组、Sema3A膜片组(每组5只),建立大鼠颅骨极限骨缺损模型,对照组植入Bio-Oss?骨粉,膜片组植入BMSC膜片和骨粉,Sema3A膜片组植入1.0 mg/L Sema3A预处理的BMSC膜片和骨粉,8周后取材分别行显微CT扫描及HE染色,比较三组BV/TV、Tb.Th及新骨形成比值分析新骨形成情况。结果:2型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞中Sema3A的表达显著低于同龄健康大鼠。使用CCK8、Transwell检测发现不同浓度Sema3A对BMSCs增殖以及迁移能力无明显影响。诱导3天时成骨相关基因ALP、COL1、BMP2、RUNX2和OCN的mRNA水平均显著增加,7天时RUNX2,BMP和OCN的mRNA水平有所下降,而ALP和COL1与第3天相比进一步增加。ALP染色、天狼星红以及茜素红染色结果显示,随着Sema3A浓度升高,ALP活性、胶原分泌能力以及矿化结节生成显著增加。3组2型糖尿病大鼠颅骨缺损区愈合情况的比较:显微CT显示,相比对照组和膜片组,Sema3A膜片组8周时新骨形成最多。Sema3A膜片组骨体积分数(BV/TV)(0.516±0.070)显著大于膜片组(0.319±0.050)(p0.05),膜片组BV/TV显著大于对照组(0.224±0.037)(p0.05)。而三组骨小梁厚度(Tb.Th)差异无统计学意义(p0.05),分别为(0.078±0.037)、(0.043±0.016)和(0.061±0.025)。HE染色分析可见,8周时膜片组新骨形成占缺损区域的比值为(0.174±0.051),显著大于对照组(0.099±0.033)(p0.05),Sema3A膜片组新骨形成比值(0.421±0.069)显著大于膜片组(p0.05)。结论:正常大鼠BMSCs中的Sema3A表达高于2型糖尿病大鼠的BMSCs,Sema3A可促进2型糖尿病大鼠BMSCs成骨相关基因的表达,促进2型糖尿病大鼠BMSCs的成骨分化。体内实验表明,联合植入骨粉和Sema3A刺激骨髓间充质干细胞膜片,可显著提高大鼠骨再生能力。因此,通过Sema3A预处理的骨髓间充质干细胞膜片移植,为提高2型糖尿病患者骨再生能力提供了新的治疗途径。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1;R783
【部分图文】：

比较图,流式细胞术,检测结果,油红

图 1 建模成功的 2 型糖尿病大鼠与正常大鼠比较图 2 2 型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的培养与鉴定 A：光学显微镜下见 BMSC 呈星形、多角形；B：成骨诱导 14 d 后茜素红染色显示红色的矿化结节；成脂诱导 14 d 后油红 O 染色显示红色的脂滴

比较图,建模,油红,间充质干细胞

图 1 建模成功的 2 型糖尿病大鼠与正常大鼠比较图 2 2 型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的培养与鉴定 A：光学显微镜下可见 BMSC 呈星形、多角形；B：成骨诱导 14 d 后茜素红染色显示红色的矿化结节；C成脂诱导 14 d 后油红 O 染色显示红色的脂滴图 3A 正常组 BMSCs 流式细胞术检测结果

Sema3A刺激BMSCs膜片对T2DM大鼠新骨形成作用的研究

BMSC-N与BMSC-DRT-qPCR及Westernblot检测

【参考文献】