Cullin 4B对胰岛δ细胞的调控作用及其机制研究
发布时间：2020-09-22 19:20
胰岛是胰腺的内分泌腺,其主要作用是感受体内的血糖水平并对其进行调节。胰岛在形态上是许多大小不等、形状不同的细胞团。其中主要的细胞类型包括α、β、δ、pp和ε等5种细胞。当人体内的血糖水平降低的情况下,比如在饥饿的状态下,胰岛α细胞会分泌胰高血糖素来促进体内的血糖水平升高。相反,如果当体内血糖水平升高的时候,胰岛β细胞会分泌胰岛素(Insulin,Ins)来降低体内的血糖水平。而δ细胞主要分泌生长抑素(Somatostatin,Sst),并以负反馈作用的方式影响α细胞和β细胞的激素分泌,从而形成一个精准的细胞调节环路。最近的研究表明,δ细胞作为胰岛细胞环路的一个重要组成部分,其功能的稳定对于维持血糖平衡非常重要。然而,胰岛δ细胞的功能在胰岛环路中的精确调控机制尚不清楚。CULLIN-RING连接酶复合物(CRLs)是目前研究发现已知的哺乳动物体内种类最多的一类E3泛素连接酶复合物,可以通过对底物进行泛素化修饰,从而改变蛋白功能或促进被修饰蛋白的降解,Cullin家族成员在此泛素连接酶复合物中起到支架蛋白的作用。哺乳动物共有8个Cullin家族成员,其中Cullin 4A(CUL4A)和Cullin4B(CUL4B)同源性很高,也有着许多相类似的生物学功能。不同的是,CUL4B的N端具有核定位序列,除了和CUL4A一样在细胞质发挥作用外,还可以定位于细胞核发挥转录调控的功能。Cullin 4通过与DDB1和RBX1形成E3连接酶复合物(CRL4B或CRL4A),这些复合物在多种生命活动中发挥关键作用。重要的是,CUL4B丧失功能突变患者表现为向心性肥胖。已有的研究表明,Cullin蛋白家族成员在胰岛功能和糖脂代谢中有着重要的调控作用。然而,CUL4B在胰岛细胞中的功能与作用目前尚未有研究报导。本研究中我们利用Cre-Loxp重组酶系统,将Ins2-Cre小鼠或Sst-Cre小鼠与Cul4bfl/fl小鼠进行交配,得到了分别在胰岛β细胞或胰岛δ细胞中特异性敲除Cul4b的两种小鼠模型。随后我们检测了两种敲除小鼠的葡萄糖代谢中的相关指标,发现只有δ细胞中特异性敲除Cul4b的小鼠,表现出糖代谢受损。其基础血糖值与对照小鼠相比没有显著差异,但是餐后血糖水平显著升高。同时葡萄糖耐受实验(Glucose tolerance test,GTT)表明该小鼠出现葡萄糖不耐受的现象。进一步,我们分离出组织特异性Cul4b敲除小鼠的胰岛进行实验,发现在胰岛δ细胞中特异性敲除Cul4b后,其由葡萄糖引起的胰岛激素分泌水平与对照组相比有着明显差异,具体表现为葡萄糖引起的胰岛δ细胞特异敲除小鼠的胰岛素分泌水平与对照小鼠相比显著降低,生长抑素分泌显著升高。结合细胞实验,我们发现在δ细胞中Cul4b缺失导致生长抑素分泌增加的这一过程中,L型钙通道Cav1.2和腺苷酸环化酶AC6发挥重要作用。我们进一步的研究发现,在胰岛δ细胞中,CRL4B-PRC2复合物通过和胰岛δ细胞的特异性转录因子HHEX相互作用,表观遗传调控Cav1.2和AC6的表达水平,从而调节生长抑素的分泌。并且长时程的高糖或者旁分泌因子UCN3可以通过调控CUL4B和EZH2的表达,引起L型钙通道Cav1.2和腺苷酸环化酶AC6的表达变化,最终在胰岛稳态和血糖调节中发挥重要作用;同时,在人的胰岛δ细胞中,也验证了 CUL4B表达下调或活力降低会促进生长抑素的分泌。研究目的本研究的目的是通过构建分别在胰岛β细胞或δ细胞中特异性敲除Cul4b的小鼠模型,来研究CUL4B在胰岛细胞中的具体功能与作用。并结合多种基因工具小鼠,应用体内和体外实验,细胞生物学,生物化学等多种手段,研究CUL4B对胰岛稳态的调控作用及其分子机制,以及在各种生理刺激条件下CUL4B的功能和相关的作用机制。研究方法1.Cl4b条件敲除小鼠的获得与鉴定Ins2-Cre+/-Culbfl/Y(胰岛β细胞中特异性敲除Cul4b)小鼠和对照小鼠是由Ins2-Cre+/-小鼠和Cul4bfl/fl小鼠交配得到的;而Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y(胰岛δ细胞中特异性敲除Cul4b)小鼠和对照小鼠是由Sst-Cre+/-小鼠和Cul4bfl/fl小鼠交配得到的。在小鼠出生后的3周或4周的时候剪鼠尾,用相关试剂盒提取小鼠基因组DNA,并使用对应的引物进行PCR,依据最终PCR产物的分子量来鉴定其小鼠基因型。2.检测敲除小鼠的糖代谢水平以及葡萄糖耐量用Ins2-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠或Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠进行实验,将得到的敲除小鼠和对照小鼠进行禁食不禁水饥饿16小时之后,测量这些小鼠的基础血糖值并进行记录。然后重新喂食2小时,再次测量血糖值并记录,将两种敲除小鼠的糖代谢水平分别与对照小鼠进行比较。类似的,将敲除小鼠和对照小鼠进行禁食不禁水饥饿16小时之后,测量小鼠的基础血糖值并进行记录。然后对这些小鼠依次进行称重,并根据小鼠的体重计算出各自需要注射的葡萄糖溶液的体积(2g/kg),在给小鼠腹腔注射完对应量的葡萄糖溶液的15分钟,30分钟,60分钟,120分钟后,分别测量小鼠的血糖值并进行记录,将两种敲除小鼠的血糖变化情况分别与对照组进行比较。3.检测敲除小鼠的胰岛形态用Ins2-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠或Sst-Cre+/-Cul4b/Y 小鼠进行实验,处死小鼠后迅速取出敲除小鼠和对照小鼠的胰腺,称重,4%多聚甲醛固定后,分别用浓度为10%,20%和30%的蔗糖溶液对胰腺进行梯度脱水处理,之后对胰腺组织进行包埋并切片染色,所使用的一抗为Insulin和Somatostatin,并用染料DAPI对细胞核进行染色。在荧光显微镜下观察染色结果并进行统计分析,检测这两种敲除小鼠分别与对照组相比,其胰岛密度,β细胞质量和δ细胞数目这三项指标是否有显著差异。4.检测敲除小鼠中的相关激素水平检测小鼠血浆中的激素水平时,我们将Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠与对照小鼠进行禁食不禁水饥饿16小时,然后进行尾部取血。并将小鼠进行重新喂食2个小时,再次进行尾部取血。将这些尾部取血得到的血液样本在室温静置30分钟,接着进行4℃离心,用枪头小心地吸取上清,然后分别用Insulin ELISA试剂盒和Somatostatin ELISA试剂盒,按照试剂盒提供的操作手册进行实验,检测血浆中的胰岛素和生长抑素的水平。检测胰岛中的总激素含量时,我们将Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠与对照小鼠的胰岛分离出来之后,首先需要用低糖完全培养基进行培养,待分离出来的胰岛恢复状态后,第二天用酸乙醇裂解培养过夜的敲除小鼠和对照小鼠胰岛,离心取上清用Insulin ELISA试剂盒检测胰岛素的总含量。或用100℃高温煮15分钟,离心取上清用Somatostatin ELISA试剂盒检测生长抑素的总含量。检测胰岛的激素分泌水平时,我们将Sst-Cre+/-Cul-4bfl/Y敲除小鼠与对照小鼠的胰岛分离出来之后,先用低糖培养基培养过夜待恢复状态,第二天用mKRBB缓冲液饥饿胰岛1小时,然后分别用高糖(20 mM Glucose)或高钾(105 mM KC1)刺激胰岛一定的时间,取上清分别用Insulin ELISA试剂盒或Somatostatin ELISA试剂盒,按照试剂盒里提供的操作手册进行实验,来检测刺激后敲除小鼠和对照小鼠胰岛中,胰岛素和生长抑素的分泌水平。5.检测原代胰岛δ细胞内钙离子水平通过荧光标记分离得到Sst-Cre+-GFPfl/+ Cul4bfl/Y小鼠和对照小鼠的原代胰岛δ细胞,首先加入Fura-2/AM溶液孵育细胞后,利用钙成像仪器检测在340 nm和380 nm波长交替激发后产生的光强度比值(F340/F380),通过光强度比值可以反映出胰岛δ细胞内钙离子的浓度变化。在我们给予原代胰岛δ细胞高糖或高钾刺激后,可以通过分析光强度比值检测胰岛δ细胞在接受刺激后细胞内的钙信号的发生频率以及细胞内钙离子浓度的改变。6.CUL4B稳筛细胞系的构建以及相关细胞实验构建CUL4B敲低的TGP52稳筛细胞系,通过ELISA的方法检测高糖引起的生长抑素分泌和细胞内cAMP水平的变化,通过Western blot和qRT-PCR实验检测钙通道和腺苷酸环化酶相关基因的mRNA以及蛋白水平。构建CUL4B过表达的TGP52稳筛细胞系,通过免疫共沉淀技术研究CUL4B对Cav1.2和AC6的调控。7.染色质免疫共沉淀(CHIP)实验通过CHIP实验研究CRL4B-PRC2复合物对Cav1.2和AC6的调控机制。分别检测CRL4B的重要成分CUL4B和DDB1,以及PRC2的重要成分EZH2,是否会和Cav1.2和AC6的启动子区域有结合,同时检测δ细胞特异性转录因子HHEX在这一过程之中是否参与发挥作用。研究结果1.我们研究发现,在小鼠的胰岛β细胞中特异性敲除Cul4b后,对其糖代谢水平以及葡萄糖耐量没有影响。而胰岛δ细胞特异性敲除Cul4b的小鼠,其餐后血糖水平与对照小鼠相比明显升高,且葡萄糖耐量受损。2.我们发现,对于胰岛δ细胞特异性敲除Cul4b的小鼠,高糖和高钾引起的胰岛素分泌水平与对照小鼠相比明显降低,而生长抑素的分泌水平明显升高。3.通过对敲除小鼠分离出来的原代胰岛δ细胞进行钙离子检测,发现胰岛δ细胞中特异性敲除CUL4B后,高糖和高钾所引起的δ细胞钙频率和钙信号变化,与野生小鼠的胰岛δ细胞相比都有显著升高。4.构建了 CUL4B敲低的TGP52稳筛细胞系,检测了相关基因的mRNA水平以及蛋白表达情况。我们发现敲低CUL4B之后,L型钙通道Cav1.2和腺苷酸环化酶AC6表达与对照组相比明显升高。并且在CUL4B敲低的TGP52细胞系中,我们发现由葡萄糖所引起的细胞内cAMP水平与对照组细胞相比有着明显升高5.构建了 CUL4B过表达的TGP52稳筛细胞系,通过免疫共沉淀实验发现CRL4B-PRC2复合物可以和HHEX发生相互作用,共同调控Cav1.2和AC6的表达,同时也证明了该复合物对Cav1.2和AC6的调控机制具有细胞特异性。6.通过对胰岛δ细胞系TGP52进行生理刺激,发现CRL4B-PRC2复合物可以通过调控Cav1.2和AC6的表达水平,进而影响胰岛δ细胞中生长抑素的分泌,以及对β细胞的负反馈调节作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：
我们选取了邋１２周鼠龄的必／此小鼠进行实验，分离出小鼠胰岛后，通过逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＣＵＬ４Ｂ以及它的同源蛋白ＣＵＬ４Ａ的表达水平，用ＧＡＰＤＨ作逡逑为内参（图１Ａ）。实验结果表明Ｗ办小鼠胰岛中ＣＵＬ４Ｂ的表达与对照小鼠相逡逑比显著降低，而ＣＵＬ４Ａ的表达与对照小鼠相比无明显变化。逡逑Ａ逦Ｂ邋°ｄｂ／＋逡逑ｏ邋ｄｂ／ｄ邋ｂ逦门一６逡逑ｄｂ／＋邋ｄｂ／ｄｂ逦１－５］邋ｎ．ｓ．逦＊＊逡逑旧：ＣＵＬ４Ａ邋—邋一一邋—逦￥逡逑ＩＢ：ＣＵＬ４Ｂ邋逦逦吾邋１０邋去’■每逡逑－？—？逡逑旧：ＧＡＰＤＨ邋？S茫浚咤危悖蓿В担咤危掊义希埃板澹桑危危危义希茫眨蹋矗铃危茫眨蹋矗洛义贤迹保粒祝澹螅簦澹恚猓欤铮簦蠹觳猓保仓苁罅涞谋兀匦∈笠鹊褐校茫眨蹋矗梁停茫眨蹋矗碌牡板义习妆泶锼健ｅ义贤迹保拢酝迹保恋耐臣品治鼋峁ｅ义希疲椋纾酰颍邋澹保粒拢澹祝澹螅簦澹颍铄澹猓欤铮簦箦澹幔睿溴澹瘢酰幔睿簦椋簦幔簦椋觯邋澹洌幔簦徨澹妫铮蝈澹茫眨蹋矗铃澹幔睿溴澹茫眨蹋矗洛澹穑颍铮簦澹椋铄义希欤澹觯澹欤箦澹椋铄澹椋螅欤澹簦箦澹妫颍铮礤澹保玻鳎澹澹耄铮欤溴澹洌椋幔猓澹簦椋沐澹洌猓洌忮澹恚椋悖邋澹幔睿溴澹簦瑁澹椋蝈澹瑁澹簦澹颍铮纾铮酰箦义希欤椋簦簦澹睿睿幔簦澹螅义希玻瑰义
本文编号：2824814
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：
我们选取了邋１２周鼠龄的必／此小鼠进行实验，分离出小鼠胰岛后，通过逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测ＣＵＬ４Ｂ以及它的同源蛋白ＣＵＬ４Ａ的表达水平，用ＧＡＰＤＨ作逡逑为内参（图１Ａ）。实验结果表明Ｗ办小鼠胰岛中ＣＵＬ４Ｂ的表达与对照小鼠相逡逑比显著降低，而ＣＵＬ４Ａ的表达与对照小鼠相比无明显变化。逡逑Ａ逦Ｂ邋°ｄｂ／＋逡逑ｏ邋ｄｂ／ｄ邋ｂ逦门一６逡逑ｄｂ／＋邋ｄｂ／ｄｂ逦１－５］邋ｎ．ｓ．逦＊＊逡逑旧：ＣＵＬ４Ａ邋—邋一一邋—逦￥逡逑ＩＢ：ＣＵＬ４Ｂ邋逦逦吾邋１０邋去’■每逡逑－？—？逡逑旧：ＧＡＰＤＨ邋？S茫浚咤危悖蓿В担咤危掊义希埃板澹桑危危危义希茫眨蹋矗铃危茫眨蹋矗洛义贤迹保粒祝澹螅簦澹恚猓欤铮簦蠹觳猓保仓苁罅涞谋兀匦∈笠鹊褐校茫眨蹋矗梁停茫眨蹋矗碌牡板义习妆泶锼健ｅ义贤迹保拢酝迹保恋耐臣品治鼋峁ｅ义希疲椋纾酰颍邋澹保粒拢澹祝澹螅簦澹颍铄澹猓欤铮簦箦澹幔睿溴澹瘢酰幔睿簦椋簦幔簦椋觯邋澹洌幔簦徨澹妫铮蝈澹茫眨蹋矗铃澹幔睿溴澹茫眨蹋矗洛澹穑颍铮簦澹椋铄义希欤澹觯澹欤箦澹椋铄澹椋螅欤澹簦箦澹妫颍铮礤澹保玻鳎澹澹耄铮欤溴澹洌椋幔猓澹簦椋沐澹洌猓洌忮澹恚椋悖邋澹幔睿溴澹簦瑁澹椋蝈澹瑁澹簦澹颍铮纾铮酰箦义希欤椋簦簦澹睿睿幔簦澹螅义希玻瑰义
本文编号：2824814
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