白介素-35对成骨细胞生物学功能的影响及机制研究

发布时间：2020-09-23 08:03

　　 目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的全身性自身免疫疾病,但其发病原因不明。其特征主要是慢性、对称性、进行性的多关节炎。由RA的慢性炎症导致的骨量丢失是最严重的的并发症之一。有研究表明,在新诊断的RA患者中,高达25%的患者在治疗前就已经发生了骨量流失,有11%的患者已发展为骨质疏松症。还有研究表明,骨量丢失与细胞因子具有密切的相关性。细胞因子调节着破骨细胞、成骨细胞和免疫系统细胞之间的相互作用,最终维持着骨代谢的平衡。白细胞介素(Interleukin,IL)-35是IL-12家族的新成员,由Epstein-Barr病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-inducible gene 3,Ebi3)亚基和p35(IL-12α)亚基组成。2007年,Vignali的研究组发现IL-35由调节性T细胞(regular T cells,Tregs)分泌并能抑制效应性T细胞的功能。我们课题组在之前研究中还发现,在小鼠胶原诱导性关节炎的成纤维样滑膜细胞中,IL-35可上调骨保护素(osteoprotegerin,OPG),并下调核因子κB受体激活剂配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)的表达,表明其在RA中具有潜在的骨保护作用。然而IL-35对RA骨量丢失的具体机制尚未明确,且研究甚少。为了更好的研究IL-35在RA骨量丢失中的作用,本研究将分析IL-35与RA患者骨量丢失相关指标的相关性,并进一步探讨IL-35对成骨细胞生物学功能的影响以及相关机制,为IL-35可能成为RA合并骨量丢失新的治疗靶点提供理论实验依据。研究方法:在第一部分的研究中,选取76名患有RA的绝经后妇女作为病例组和53名健康的绝经后妇女作为健康对照组。通过酶联免疫吸附测定法检测血清IL-35水平。使用双能X射线吸收测定法测量腰椎(L1-L4)和全髋骨的骨矿物质密度。通过免疫比浊法测定骨转换标志物,包括碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP),I型胶原羧基β端肽特殊序列(cross-linked C-terminal telopeptid of type I Collagen I,β-CTX)和25-(OH)VitD_3。在第二部分研究中,选取小鼠前成骨细胞MC3T3E1细胞系为研究对象。拟用TNF-α刺激诱导MC3T3E1细胞系模拟成骨细胞在RA中的炎性环境。用CCK-8和流式细胞术检测IL-35对MC3T3E1细胞系增殖和凋亡的影响。用pNPP偶氮法检测ALP的活性。用RT-PCR和Western-blot检测MC3T3E1细胞中OPG和RANKL的表达水平。用茜素红染色检测MC3T3E1细胞系体外的矿化能力。在第三部分研究中,加入外源性Dkk-1阻断Wnt/β-catenin通路,探讨IL-35影响成骨细胞生物学功能的可能性机制。结果:在第一部分研究中:1.绝经后RA女性的血清IL-35水平高于健康对照组(P0.0001)。2.与骨质减少和骨质疏松症患者相比,骨量正常的患者血清IL-35水平显著升高(分别为P0.0001,P0.0001)。3.血清IL-35水平与腰椎(L1-L4)骨密度(r=0.64,P0.0001)和全髋关节骨密度为(r=0.43,P=0.0001)呈正相关。4.血清IL-35水平与β-CTX呈负相关(r=-0.35,P=0.0017)。血清IL-35水平与ALP无关(r=0.2,P=0.077)。但ALP组增加组的血清IL-35水平高于正常ALP组(P=0.0006)。5.血清IL-35水平与25(OH)VitD_3呈正相关(r=0.37,P=0.0011)。6.在多因素线性回归模型中,IL-35在腰椎(L1-L4)和全髋的BMD中保持显著相关性(OR=0.463,P=0.026;OR=0.254,P=0.025)。在第二部分研究中:1.CCK-8结果显示,经过IL-35处理的第1天、第3天、第5天和第7天,与空白对照组比较(IL-35为0ng/mL),IL-35促进MC3T3E1细胞的增殖(P0.05)。在经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,IL-35也促进MC3T3E1细胞的增殖(P0.05),说明IL-35对MC3T3E1和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖具有促进作用。2.流式细胞术结果显示,经过不同浓度的IL-35(25、50、100ng/mL)处理后,与空白对照组比较(IL-35为0ng/mL),MC3T3E1细胞的凋亡降低(P0.05),说明IL-35对MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡具有抑制作用。3.pNPP偶氮法结果显示,在MC3T3E1细胞系和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,经过第3天、第5天、第7天和第9天,经过IL-35(50ng/mL)处理后,与空白对照组比较(IL-35为0ng/mL),MC3T3E1细胞的ALP活性显著增强(P0.05),说明IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP的活性。4.RT-PCR和Western-blot结果显示,MC3T3E1和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,与空白组(IL-35为0ng/mL)比较,IL-35显著升高OPG的表达(P0.05),显著降低RANKL的表达(P0.05)。另外,我们的研究还发现,经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞的OPG、RANKL的表达比未经TNF-α处理的MC3T3E1细胞的OPG、RANKL的表达也是显著升高的(P0.05)。5.茜素红染色结果显示,在MC3T3E1和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,经过矿化液诱导的第20天,与空白对照组比较(IL-35为0ng/mL),MC3T3E1细胞的体外矿化能力显著增强(P0.05),说明IL-35对MC3T3E1细胞系的体外矿化能力具有促进作用。在第三部分研究中:1.加入外源性Dkk-1后,IL-35诱导的MC3T3E1细胞增殖显著下降(P0.05)。2.IL-35诱导的MC3T3E1的细胞凋亡显著升高(P0.05)。3.IL-35诱导的ALP活性显著下降(P0.05)。4.体外矿化能力也显著下降(P0.05)。5.MC3T3E1细胞表达的OPG和RANKL也显著下调(P0.05)。结论:在第一部分研究中:血清IL-35水平与绝经后RA患者的BMD,骨代谢指标和维生素D水平相关,提示IL-35在RA骨丢失的发生发展中具有重要的作用。在第二部分研究中:1.IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖。2.IL-35抑制MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡。3.IL-35增加MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP活性。4.IL-35增加MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系OPG mRNA和蛋白的表达,降低RANKL mRNA和蛋白的表达。5.IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系体外矿化的能力。在第三部分研究中:1.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖。2.IL-35通过Wnt/β-catenin途径抑制TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡。3.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP活性。4.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系外矿化能力。5.IL-35通过Wnt/β-catenin途径上调TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的OPG表达,同时下调RANKL的表达。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

35 在绝经期 RA 患者和健康对照组中的比较。结果显示，RA 患者 IL-35 显著高于健康对照组（P<0.0001）。患者 IL-35 的血清水平与 BMD 的相关性分析据 WHO 骨质疏松诊断标准将 RA 患者分为 3 组：分别为 BM、骨量减少组（n=44）和骨质疏松组（n=15），比较三组中 IL显示，与骨量减少组（5.9（4.3-6.4）pg/mL）和骨质疏松组（4.比，骨量正常组的 RA 患者血清 IL-35 水平显著升高(11.8（6.7-3 P<0.0001，P<0.0001）。但骨量减少组和骨质疏松组中的 IL-3差异（P=0.1667）（图 3.2.1）。单因素相关分析结果显示，血（L1-L4）BMD 呈正相关（r=0.64，P<0.0001）（图 3.2.2），同D 呈正相关（r=0.43，P=0.0001）（图 3.2.3）。

5 在不同组间的血清水平比较。根据 WHO 骨质疏松诊断标准将 RA 患者 正常组（n=17）、骨量减少组（n=44）和骨质疏松组（n=15），比较三。结果显示，与骨量减少组和骨质疏松组相比，骨量正常组的 RA 患者高（分别为 P<0.0001，P<0.0001）。骨量减少组和骨质疏松组中的 IL-3无统计学差异（P=0.1667）。

-35 在不同组间的血清水平比较。根据 WHO 骨质疏松诊断标准将 RA 患者D 正常组（n=17）、骨量减少组（n=44）和骨质疏松组（n=15），比较三平。结果显示，与骨量减少组和骨质疏松组相比，骨量正常组的 RA 患者升高（分别为 P<0.0001，P<0.0001）。骨量减少组和骨质疏松组中的 IL-3无统计学差异（P=0.1667）。

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