三磷酸腺苷结合盒转运体A1介导的胆固醇代谢参与糖尿病认知功能障碍的发生

发布时间：2020-09-24 12:18

　　 第一部分ABCA1与脂代谢紊乱和2型糖尿病轻度认知功能障碍的相关性研究背景:脂代谢紊乱不仅是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的危险因素,也与神经退行性疾病密切相关。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)的遗传变异与脂质和β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)代谢均有关。因此,ABCA1可能在糖尿病认知功能障碍的发生发展中起重要作用。目的:研究ABCA1 R219K基因多态性与外周血脂水平、2型糖尿病轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)的相关性,探讨ABCA1 R219K基因多态性对2型糖尿病MCI的预测价值。方法:本研究采用病例-对照设计方法,入组226位2型糖尿病患者。根据蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)得分将受试者分为认知功能正常组和轻度认知功能障碍组。患者入组后收集血压、血糖、糖化血红蛋白、外周血脂等临床资料,并进行神经心理学量表测试。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法测定ABCA1R219K基因多态性。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果:1、与认知功能正常组相比,2型糖尿病MCI组外周高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-c)和载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,apoA-I)水平显著下降,总胆固醇水平显著升高。2、校正年龄后,在总人群和MCI组中,受教育年限(r=0.474,P0.001;r=0.471,P0.001)、HDL-c(r=0.143,P=0.043;r=0.301,P=0.001)和apoA-I(r=0.146,P=0.039;r=0.230,P=0.016)水平与MoCA得分呈正相关,年龄和MoCA得分呈负相关(r=-0.253;P0.001;r=-0.208;P=0.020)。3、分层分析显示,与低HDL-c组相比,高HDL-c组患者词语记忆、视觉记忆、逻辑记忆及工作记忆得分较高(P0.05)。4、ABCA1 R219K不同基因型及等位基因频率在2型糖尿病MCI及认知正常组之间无统计学差异。5、MCI组RR、RK、KK基因型中,apoA-I水平依次上升,RR与KK基因型之间有统计学差异;HDL-c水平在三种基因型中呈上升趋势,但不同基因型之间无统计学意义(P=0.055)。结论:ABCA1 R219K基因型对HDL-c水平可能产生影响;HDL-c对2型糖尿病患者的认知功能,尤其是记忆功能起到保护作用。ABCA1 R219K基因多态性在2型糖尿病MCI和认知正常人群中未发现显著统计学差异,需要进一步扩大样本量明确其多态性是否通过影响脂质代谢参与糖尿病认知功能障碍的发生。第二部分LXR-β激活通过ABCA1改善KKAy小鼠的认知功能背景:胆固醇代谢紊乱是2型糖尿病和阿尔茨海默病共同的病理基础,可能与糖尿病认知功能障碍的发生有关。肝X受体(liver X receptor,LXR)是氧化固醇激活的核受体,它通过调节与胆固醇转运相关的基因,如ABCA1的表达来调节细胞内胆固醇水平。LXR激动剂可激活LXR-β,上调ABCA1基因的表达,调节胆固醇流出,减少Aβ水平。糖尿病患者ABCA1水平明显下降,寻找有效手段上调ABCA1的表达可能是防治糖尿病认知功能障碍新的靶点。目的:观察LXR激动剂是否通过调节ABCA1蛋白水平改善KKAy小鼠认知功能损害及其对脑组织Aβ代谢的影响。方法:以KKAy小鼠作为2型糖尿病认知功能障碍的动物模型,不同浓度T0901317(低剂量:5mg/kg/d;中剂量:10mg/kg/d;高剂量:20mg/kg/d)灌胃,对小鼠进行预防和治疗。预防组小鼠在9周龄给予T0901317灌胃12周,治疗组小鼠在15周龄给予T0901317灌胃6周,对照组小鼠给予溶媒灌胃。避暗实验和Morris水迷宫实验用于检测小鼠行为学变化;HE和尼氏染色检测糖尿病小鼠脑组织的形态学改变;免疫组化染色检测小鼠海马组织LXR-β、ABCAl和Aβ42的表达情况;RT-PCR和Western Blot用于测定小鼠海马组织LXR-β、ABCAl的m RNA和蛋白表达水平。结果:1、KKAy小鼠体质量、空腹血糖、总胆固醇及高密度脂蛋白水平均显著高于同周龄正常组小鼠;与糖尿病模型组相比,T0901317对小鼠体质量无明显影响,T0901317预防或治疗组空腹血糖和总胆固醇下降,高密度脂蛋白水平升高。2、避暗实验中,与正常对照组小鼠相比,糖尿病模型组小鼠避暗潜伏期缩短,错误次数增加;Morris水迷宫结果显示,模型组小鼠登台潜伏期延长,穿越平台次数和目标象限停留时间减少。不同浓度T0901317预防或治疗后,小鼠学习记忆能力均明显改善。3、与对照组小鼠相比,T0901317预防及治疗组小鼠海马神经元结构有不同程度改善,细胞形态破坏减轻,排列较整齐,细胞皱缩现象减少,胞浆内仍有较多尼氏小体。4、免疫组化染色显示,模型组小鼠较对照组小鼠海马组织中LXR-β和ABCAl的IOD值显著减少;Aβ着色较深,但未达到统计学意义;经T0901317处理后,海马组织LXR-β和ABCAl的IOD值明显增加,Aβ42生成显著减少。5、糖尿病模型组小鼠脑内LXR-β和ABCAl的m RNA及蛋白水平明显下降,T0901317预防和治疗后LXR-β及ABCAl的m RNA表达增加,其相应蛋白表达含量也显著增加,差异有统计学意义。结论:ABCA1参与糖尿病认知功能障碍的发生,可能对认知功能起保护作用。LXR-β激动剂可能通过升高ABCA1水平并减少Aβ沉积从而改善糖尿病认知功能障碍。第三部分LXR-β激活通过增加ABCA1的表达调节PC12细胞Aβ代谢背景:Aβ代谢与2型糖尿病认知功能障碍的发生发展密切相关。前期实验结果表明LXR-β激动剂可通过上调ABCA1表达和减少Aβ水平改善KKAy小鼠学习记忆能力。但LXR-β激动剂调节糖尿病状态下Aβ代谢的机制尚未明确。目的:观察T0901317对高糖培养的PC12细胞胆固醇及Aβ代谢的影响;探究T0901317是否通过LXR-β介导的ABCA1胆固醇转运体系促进细胞内胆固醇流出从而调节Aβ代谢,阐述其可能的机制。方法:选取神经生长因子诱导分化后的PC12细胞,予高糖培养和T0901317进行干预;试剂盒检测细胞培养液胆固醇浓度,计算胆固醇流出;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测Aβ42水平;RT-PCR和Western Blot用于检测LXR-β、ABCAl、APP、ADAM10和BACE1的m RNA和蛋白表达水平。通过LXR-βsi RNA和ABCA1si RNA抑制LXR-β和ABCAl表达后,试剂盒检测细胞培养液胆固醇浓度;ELISA检测Aβ42水平;并对LXR-β、ABCAl、APP、ADAM10和BACE1的m RNA和蛋白表达进行检测,观察ABCAl胆固醇转运体系对Aβ42代谢的影响。结果:1、与正常对照组相比,高糖处理组LXR-β、ABCA1和ADAM10的m RNA和蛋白表达水平下降,APP和BACE1的m RNA和蛋白含量显著增加,胆固醇流出减少,Aβ42生成增多;与高糖组相比,T0901317干预后,LXR-β和ABCA1的m RNA和蛋白水平显著增加,BACE1蛋白表达下降,胆固醇流出增加,Aβ42水平减少。2、LXR-βsi RNA抑制LXR-β表达后,T0901317上调LXR-β和ABCA1蛋白作用被拮抗,其促进PC12细胞胆固醇流出、减少BACE1蛋白及Aβ42生成的作用也显著减弱。3、ABCA1 si RNA抑制PC12细胞ABCA1表达后,LXR-β的m RNA和蛋白含量无明显变化,而T0901317促进ABCA1蛋白表达的作用明显下降;T0901317促进PC12细胞内胆固醇流出、减少细胞BACE1蛋白及Aβ42生成的作用也受到显著抑制。结论:ABCA1介导的胆固醇代谢参与糖尿病认知功能损害的发生。T0901317可以通过上调ABCA1的表达促进细胞胆固醇流出,减少BACE1蛋白水平和Aβ的生成,从而缓解高糖对PC12细胞的损伤。T0901317增加PC12细胞ABCA1表达、促进细胞内胆固醇流出、减少BACE1蛋白及Aβ生成的作用在LXR-βsi RNA或ABCA1 si RNA处理后均被抑制。表明LXR-β激活可能通过上调高糖损伤的ABCA1的表达,促进细胞胆固醇流出,进而减少BACE1蛋白表达来调节Aβ代谢。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：

到第四天以后，低中高剂量预防组小鼠的登台潜伏期均较溶媒对照组明显缩短（P < 0.05）（表 2.2，图2.1）；21 周龄时，在训练前两天，各组 KKAy小鼠登台潜伏期结果相似，第三天开始，T0901317预防及治疗组小鼠登台潜伏期出现下降，中高剂量预防及治疗组与溶媒对照组相比有明显统计学差异（P < 0.05），第四天和第五天时，T0901317 用药各组的潜伏期与溶媒组相比均显著下降（P < 0.05）（表 2.3，图 2.2, 图 2.3）。表 2.2 各组小鼠 15 周定位航行实验登台潜伏期结果比较 （ x±s，n=8 ）组别潜伏期(s)第一天 第二天 第三天 第四天 第五天正常对照组 57.18 ±19.21 50.45 ±17.03 38.53 ±13.21 27.44 ±9.50 21.45 ±9.79模型对照组 78.11 ±17.88*77.44 ±18.62*64.00 ±16.43*53.78 ±12.93*42.33 ±10.05*溶媒对照组 81.07 ±17.08*76.00 ±18.62*65.88 ±12.61*55.13 ±9.99*46.88 ±8.04*低剂量预防组 77.62 ±21.40 66.15 ±14.33 53.01 ±14.76 42.78 ±14.81#37.58 ±9.17#中剂量预防组 73.15 ±15.91 61.39 ±14.09#50.96 ±17.68#34.52 ±15.29#36.34 ±11.26#高剂量预防组 74.36 ±20.49 61.09 ±12.31#47.77 ±17.10#37.95 ±11.36#33.53 ±9.98#*与正常对照组相比，P < 0.05；#与溶媒对照组相比

组别潜伏期(s)第一天 第二天 第三天 第四天 第五天正常对照组 62.34 ±19.48 57.78 ±18.34 41.59 ±11.68 34.02 ±11.57 24.48 ±14.62模型对照组 83.13 ±20.86*78.38 ±14.55*71.63 ±13.71*61.88 ±15.07*45.63 ±11.10*溶媒对照组 86.25 ±21.27*81.13 ±16.92*72.75 ±17.50*58.25 ±14.81*49.63 ±13.48*低剂量预防组 76.89 ±18.99 75.89 ±16.14 62.22 ±12.37 40.00 ±15.15#37.11 ±11.96#中剂量预防组 70.56 ±19.84 66.67 ±14.86 55.00 ±13.04#35.78 ±12.90#35.78 ±9.99#高剂量预防组 67.66 ±15.41#69.28 ±14.56 52.41 ±13.18#35.57 ±15.61#30.03 ±11.05#低剂量治疗组 79.56 ±19.83 77.11 ±14.41 64.44 ±18.39 42.56 ±12.37#37.56 ±10.89#中剂量治疗组 72.59 ±19.50 69.75 ±11.23 58.30 ±11.51#44.68 ±13.07#37.47 ±11.26#高剂量治疗组 69.93 ±18.37 69.25 ±16.23 55.50 ±13.97#38.28 ±14.16#31.94 ±14.55#*与正常对照组相比，P < 0.05；#与溶媒对照组相比，P < 0.05））

组别潜伏期(s)第一天 第二天 第三天 第四天 第五天正常对照组 62.34 ±19.48 57.78 ±18.34 41.59 ±11.68 34.02 ±11.57 24.48 ±14.62模型对照组 83.13 ±20.86*78.38 ±14.55*71.63 ±13.71*61.88 ±15.07*45.63 ±11.10*溶媒对照组 86.25 ±21.27*81.13 ±16.92*72.75 ±17.50*58.25 ±14.81*49.63 ±13.48*低剂量预防组 76.89 ±18.99 75.89 ±16.14 62.22 ±12.37 40.00 ±15.15#37.11 ±11.96#中剂量预防组 70.56 ±19.84 66.67 ±14.86 55.00 ±13.04#35.78 ±12.90#35.78 ±9.99#高剂量预防组 67.66 ±15.41#69.28 ±14.56 52.41 ±13.18#35.57 ±15.61#30.03 ±11.05#低剂量治疗组 79.56 ±19.83 77.11 ±14.41 64.44 ±18.39 42.56 ±12.37#37.56 ±10.89#中剂量治疗组 72.59 ±19.50 69.75 ±11.23 58.30 ±11.51#44.68 ±13.07#37.47 ±11.26#高剂量治疗组 69.93 ±18.37 69.25 ±16.23 55.50 ±13.97#38.28 ±14.16#31.94 ±14.55#*与正常对照组相比，P < 0.05；#与溶媒对照组相比，P < 0.05））

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