Niclosamide及其衍生物DK-520对RANKL诱导的破骨细胞早期融合及分化的影响

发布时间：2020-09-24 12:46

　　骨质疏松症被世界卫生组织(WHO)评为第二大危害人类健康的疾病,仅次于心血管疾病。我国随着改革开放带来的高度城市化、人口老龄化进程的不断加快和不健康生活方式的广泛流行,骨质疏松症的患病率日渐升高。据2018年10月国家卫生健康委员会和疾病预防控制中心发布的最新骨质疏松症流行病学调查结果表明:骨质疏松症在50岁以上人群中的患病率为19.2%,65岁以上为32.0%,其中女性患病率高达51.6%。骨质疏松症引起的脆性骨折严重降低了患者的生活质量,老年患者髋部骨折后1年内的死亡率高达20%,给家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此,重视骨质疏松症的防治,防止骨折的发生具有重要的社会意义。破骨细胞(Osteoclast,OC)和成骨细胞(Osteoblast,OB)在稳定的骨重建及骨代谢过程中发挥着重要的作用。破骨细胞的分化依赖细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligands,RANKL)和破骨细胞前体细胞膜的细胞核因子κB受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B,RANK)的相互作用,并受多种信号途径和转录因子的调节。首先,转录因子PU.1[Spleen focus-forming virus(SFFV)proviral integration 1]与NFATc1启动子直接结合,使NFATc1表达增加,并促进破骨细胞前体细胞的发育。其次,RANKL通过介导下游信号分子核转录因子kappa B(NF-κB)、c-Jun、活化T细胞核因子c1(NFATc1)以及p38/c-Fos(Cellular oncogene fos)的表达,调控破骨细胞的分化。在此过程中,破骨细胞前体细胞(Osteoclast precursor cells,OCPs)之间的融合是多核破骨细胞生成的必要条件,而树突状细胞特异性跨膜蛋白(Dendritic cell-specific transmembrane protein,DC-STAMP)及空泡型质子泵(H+-ATP酶)是介导细胞融合的重要因素。目前,治疗骨质疏松的药物仍以双膦酸盐类为代表性药物的骨吸收抑制剂为主,然而长期治疗存在价格较高、患者依从性差、口服制剂消化道黏膜副作用大、静脉制剂可引起下颌骨坏死及非典型骨折等问题。此外随着研究的不断深入,还有许多作用于破骨细胞的药物将在未来应用于骨质疏松患者的治疗,如抗RANKL单克隆抗体、C-src激酶抑制剂及组织蛋白酶K抑制剂等。Niclosamide(氯硝柳胺)是WHO推荐的一种灭螺药。近年来,研究发现它可作用于Wnt、NF-κB、Notch及STAT-3等多种细胞通路,干扰细胞代谢,影响细胞生长甚至诱导细胞死亡;还可通过抑制c-Fos、c-jun及c-Myc等,降低脂多糖诱导的树突状细胞的成熟及多种细胞因子的表达,抑制骨肉瘤细胞的增殖。上述通路和细胞因子同样涉及破骨细胞的分化及骨吸收过程,有研究报道Niclosamide作为ATPase抑制剂可通过抑制破骨细胞泌酸来减少骨吸收。Niclosamide在应用于其他疾病时有别于灭螺,为提高其在体内的生物利用度,近年来也在不断改进化学结构,其中DK-520是Niclosamide的酰基衍生物,在体内代谢成Niclosamide,通过结构的变化可提高口服血药浓度及生物利用度并延长暴露时间。该课题通过研究Niclosamide和DK-520对破骨细胞分化过程的影响及对调控破骨细胞早期融合及分化过程中的主要因子PU.1、DC-STAMP及ATPaseV_0d_2表达的影响,明确Niclosamide和DK-520抑制破骨细胞的主要分子机制,期望对骨质疏松症的临床治疗提供新的方向,达到“老药新用”的目的。一、RANKL和M-CSF诱导破骨细胞分化成熟目的:利用RANKL和M-CSF将小鼠骨髓源性的单核/巨噬细胞诱导为破骨细胞并予以鉴定,为体外研究破骨细胞的分化和功能提供研究基础。方法:取4-8周龄的C57BL/6小鼠,分离胫骨与股骨,提取单核/巨噬细胞,利用RANKL和M-CSF诱导分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察细胞形态,RT-PCR检测破骨细胞表型基因,对诱导形成的破骨细胞予以鉴定。结果:TRAP染色结果显示阳性的多核细胞出现,RT-PCR结果表明有破骨细胞表型基因的表达。结论:从C57BL/6小鼠股骨与胫骨中提取的骨髓单核/巨噬细胞可在RANKL和M-CSF诱导下产生破骨细胞。二、Niclosamide和DK-520对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响目的:该部分提取骨髓源性的单核/巨噬细胞,以RANKL和M-CSF诱导培养OC,给与不同浓度Niclosamide和DK-520干预,评价两种药物对TRAP阳性多核破骨细胞分化的影响。方法:首先采用CCK-8检测药物剂量毒性,选取合适的药物浓度进行后续实验。按干预药物的种类及浓度分5组:DMSO对照组、Niclosamide 0.75μM组、Niclosamide1.5μM组、DK-520 0.75μM组及DK-520 1.5μM组。为明确Niclosamide和DK-520的药物作用发生在破骨细胞分化的时间周期,以0-1天,1-2天,2-3天,3-4天的不同时间点分别给药处理。培养3天后,分别对各干预组与DMSO对照组细胞进行TRAP染色并计数,比较干预组和对照组间OC数量与大小的差异。结果:与对照组相比,干预组TRAP染色阳性的破骨细胞形成明显减少(p0.05),且具有体积小、多核细胞少的特征,并与药物浓度呈剂量依赖性关系;不同时间点给药处理后的结果显示,TRAP阳性破骨细胞在早期阶段数量即明显减少(p0.05)。结论:Niclosamide和DK-520剂量依赖性抑制破骨细胞的生成,其作用发生在破骨细胞分化的早期阶段。三、Niclosamide和DK-520对RANKL诱导的PU.1,DC-STAMP及ATPaseV_0d_2表达的影响目的:拟通过检测RANKL诱导的OCPs向成熟破骨细胞分化过程中PU.1,DC-STAMP及ATPaseV_0d_2的表达水平,探讨Niclosamide和DK-520影响破骨细胞分化的具体分子机制。方法:按干预药物的种类及浓度将培养细胞分为:DMSO对照组、Niclosamide 0.75μM组、Niclosamide 1.5μM组、DK-520 0.75μM组及DK-520 1.5μM组,并按不同时间点分别给药处理。按1×10~5/孔浓度将骨髓单核/巨噬细胞接种于6孔板中,培养2-3天,分别在0-1天和1-2天时加入RANKL、M-CSF以及药物干预处理,继续培养24小时,利用RT-PCR及Western Blot,检测PU.1、DC-STAMP与ATPaseV_0d_2的表达水平。结果:实时荧光定量PCR结果表明,在0-1天和1-2天,不同浓度Niclosamide及DK-520组PU.1基因表达水平均较对照组明显降低,差异有统计学意义(p0.05);Western Blot结果表明,各干预组的DC-STAMP蛋白表达水平均较对照组降低(p0.05);干预组与对照组中ATPaseV_0d_2的表达水平无明显差异(p0.05)。结论:Niclosamide和DK-520可抑制破骨细胞早期分化阶段转录因子PU.1与OCPs融合介导因子DC-STAMP的表达,从而抑制破骨细胞的分化。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R580
【部分图文】：

破骨细胞,表型,相差显微镜,基因

图 1：破骨细胞的鉴定注：A:倒置相差显微镜下 TRAP 染色观察（40×）；B:破骨细胞表型基因 TRAP、RANK 及 CtK mRNA 的表达水平（**p<0.001,#p<0.01）。3 结论从 C57/BL6 小鼠体内提取单核/巨噬细胞，加入 M-CSF 和 RANKL 诱导培养 3-天后，TRAP 染色鉴定有破骨细胞生成，并可检测到 RANK、TRAP、CatK 等破骨细胞表型基因标志物的表达。4 讨论破骨细胞是一种终末分化细胞，在骨吸收中起重要作用[7]。成熟破骨细胞的形成

破骨细胞,药物毒性,组间,硕士学位论文

山西医科大学硕士学位论文2.2 CCK-8 实验结果CCK-8 检测细胞增殖与药物毒性发现，Niclosamide 在浓度小于 1.75μM 时，各组间无明显差异，各药物浓度对破骨细胞前体细胞均无明显的毒性作用；DK-520 在浓度小于 2μM 时对破骨细胞前体细胞无明显毒性作用。在由 M-CSF 和RANKL诱导 3天后的成熟破骨细胞中分别加入 DMSO 及不同浓度的 Niclosamide和 DK-520 培养 24 小时后检测，各组间无明显差异。在 CCK-8 药物毒性检测的基础上，选取 Niclosamide 和 DK-520 0.75μM 和 1.5μM 进行后续实验（图 2）。

破骨细胞,相差显微镜

图 3：不同浓度 Niclosamide 和 DK-520 抑制破骨细胞分化注：（A）培养板中细胞 TRAP 染色观察；（B）倒置相差显微镜下不同浓度 Niclosamide 干预 24 小时后细形态（40×）；（C）倒置相差显微镜下不同浓度 Niclosamide 干预 24 小时后细胞数量；（D）倒置相差显微镜下同浓度 DK-520 干预 24 小时后细胞形态（40×）；（E）倒置相差显微镜下不同浓度 DK-520 干预 24 小时后细胞量（**p<0.001）。（2）按不同时间点即 0-1、1-2、2-3、3-4 天分别给药处理后，与 DMSO 对照组相比TRAP 阳性的破骨细胞数量减少，体积变小，且在早期阶段差异最显著（图 4）。

【相似文献】