骨髓神经neuritin对2型糖尿病周围神经病变治疗的影响研究

发布时间：2020-09-28 09:51

　　 目的:研究在2型糖尿病(dbdb)小鼠模型中,骨髓高表达神经营养因子neuritin对外周神经病变的影响及其作用机制。方法:1.构建骨髓特异性高表达neuritin的转基因小鼠,用构建的高表达neuritin与db/m杂合子杂交获得高表达neuritin的2型糖尿病小鼠;将实验分为8组:(1)正常对照组(db/m)小鼠(2)2型糖尿病组(TD2)小鼠(3)2型糖尿病+二甲双胍组(TD2+MET)小鼠(4)高表达neuritin+2型糖尿病组(A/Lyz-Cre+TD2)小鼠(5)高表达neuritin+2型糖尿病+二甲双胍组(A/Lyz-Cre+TD2+MET)小鼠(6)高表达neuritin+db/m小鼠组(A/Lyz-Cre+db/m)小鼠,从第10周鼠龄开始喂药,连续给药8周,每周测1次体重,每两周测1次空腹血糖。2.喂药结束后,对各组小鼠进行神经传导检测,观察小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量;用ELISA对各组小鼠骨髓上清、血浆、坐骨神经上清的SDF-1进行检测。3.用HE和油红O染色,检测各组小鼠骨髓病理结构和脂肪堆积;用激光共聚焦结合免疫荧光组织化学检测各组小鼠骨髓神经密度(TH)、微血管密度(CD31)、骨髓neuritin的表达。4.用透射电镜检测各组小鼠坐骨神经病理的结构,用激光共聚焦结合免疫荧光组织化学检测各组小鼠坐骨神经的神经元再生(GAP43)、神经纤维密度(NF200)、神经髓鞘化(GFAP)、雪旺细胞的增殖(S100+Brdu)。5.采用骨髓提原代BMSC进行体外迁移实验,检测SDF-1α,AMD3100(CXCR4抑制剂)、Ly294002(Pakt抑制剂)对BMSC迁移的影响,以及观察2型糖尿病状和2型糖尿病骨髓高表达neuritin状态下BMSC迁移的变化;用激光共聚焦结合免疫荧光组织化学检测骨髓CXCR4、SDF-1α的表达以及坐骨神经Pakt的表达。结果:1.TD2小鼠的MNCV和SNCV显著低于db/m小鼠(P0.05),治疗组小鼠(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠、TD2+MET小鼠)的MNCV和SNCV有明显改善(P0.05)。2.治疗组小鼠在经过8周研究治疗时出现血糖进展减缓,喂药结束后血糖显著低于TD2小鼠(P0.05);且相较于TD2小鼠,2型糖尿病骨髓高表达neuritin模型(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)的体重明显减轻(P0.05),而TD2+MET小鼠体重无明显变化;治疗组小鼠的血清TC、LDL-C含量低于TD2小鼠但不具有统计意义(P0.05),而它们的TG含量低于TD2小鼠且差异显著(P0.05);对于HDL-C,2型糖尿病骨髓高表达neuritin模型显著高于TD2小鼠(P0.05),而TD2+MET小鼠只略高于TD2小鼠但不具有统计意义(P0.05)。3.股骨HE染色表明:相较于TD2小鼠,治疗组小鼠的细胞密度明显改善,且均低于db/m小鼠和A/Lyz-Cre+db/m小鼠(P0.05);油红O染色表明:治疗组小鼠的油红O阳性率与TD2小鼠相比无显著差异(P0.05),且均显著高于db/m小鼠和A/Lyz-Cre+db/m小鼠(P0.05);4.股骨免疫荧光染色表明:与db/m小鼠、A/Lyz-Cre+db/m小鼠相比,TD2小鼠骨髓CD31阳性面积和骨髓TH阳性率大大降低(P_(CD31)0.001,P_(TH)0.05),而治疗组相较于TD2小鼠,其骨髓CD31阳性面积和骨髓TH阳性率有明显提高(P_(CD31)0.05,P_(TH)0.05)。5.在透射电镜下TD2小鼠的坐骨神经表现为线粒体脊消失、线粒体外膜肿胀、神经轴索膜与髓鞘膜分离、髓鞘板层结构消失的症状,MET治疗后其病理症状有轻微程度减轻,而2型糖尿病骨髓高表达neuritin模型的以上症状有明显改善;坐骨神经免疫荧光染色表明:TD2小鼠、TD2+MET小鼠的坐骨神经GAP43表达量显著低于骨髓高表达neuritin模型(A/Lyz-Cre+db/m小鼠、A/Lyz-Cre+TD2小鼠和A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)(P0.01);TD2小鼠相较于db/m小鼠、A/Lyz-Cre+db/m小鼠坐骨神经施旺细胞的增殖速率(Brdu+S100)显著降低(P0.05),2型糖尿病骨髓高表达neuritin模型相较于TD2小鼠坐骨神经施旺细胞的增殖速率明显改善(P0.01);TD2小鼠、TD2+MET小鼠坐骨神经GFAP分布区域远低于db/m小鼠(P0.05),2型糖尿病骨髓高表达neuritin模型比TD2小鼠坐骨神经GFAP分布显著增多(P0.01)。而各模型鼠间坐骨神经NF200表达量无显著性差异。6.BMSC体外迁移结果显示:SDF-1α确实能够增强BMSC的迁移,并且是沿着SDF-1α浓度梯度方向迁移的,当用CXCR4抑制剂(AMD3100)和Pakt抑制剂(Ly94002)处理后,BMSC的迁移能力显著降低;TD2小鼠的BMSC迁移率显著低于db/m小鼠,而在2型糖尿病状态下骨髓高表达neuritin有助于BMSC的迁移;ELISA实验结果显示:2型糖尿病状态下坐骨神经的SDF-1α浓度明显增高,而在骨髓高表达neuritin的模型鼠中(A/Lyz-Cre+TD2小鼠、A/Lyz-Cre+TD2+MET小鼠)SDF-1α浓度按骨髓-血浆-坐骨神经梯度分布率更明显;通过股骨切片的SDF-1α+CXCR4免疫荧光染色显示:在2型糖尿病状态下(包括2型糖尿病骨髓高表达neuritin的模型鼠)小鼠骨髓的SDF-1α与CXCR4有共定位;通过坐骨神经切片的GFAP+Pakt免疫荧光染色显示:2型糖尿病状态下小鼠坐骨神经髓鞘受到损伤会激活Pakt,而骨髓高表达neuritin也会促进Pakt的激活。结论:1.骨髓神经neuritin能修复2型糖尿病骨髓神经病变,改善骨髓功能。2.骨髓神经neuritin能提高骨髓间充质干细胞的迁移能力。3.骨髓神经neuritin修复2型糖尿病外周神经病变是通过SDF-1α/CXCR4轴激活PI3K/Akt通路来实现的,推测骨髓间充质干细胞参与其中发挥着重要的修复作用。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文46图4 各组小鼠骨髓细胞密度和脂肪体积比较。（A）各组小鼠股骨HE染色（100×）左图显示典型区域放大（400×）； （B）各组小鼠股骨油红O染色（400×）（C）对各组小鼠股骨细胞密度的定量分析；（D）对各组小鼠股骨油红O阳性区域面积的定量分析；与正常组相比**P <0.01，与2型糖尿病组相比##P <0.05。Figure 4 The comparison of bone marrow cell density and fat volume of mouse in eachgroup. (A)The femur HE staining (100 ×), the left shows the typical area magnification (400×). (B) The femur with oil red O staining (400 ×). (C) Quantitative of cell density of femur.(D) Quantitative of positive area of the femur with oil red O .**P <0.01vs control group,##P<0.05 vs type 2 diabetes group.5.2 小鼠骨髓微血管病变 与正常对照db/m小鼠组和高表达neuritin+db/m小鼠组相比，2型糖尿病组小鼠骨髓CD31阳性面积大大降低，即累积的血管密度显著性减少（P<0.001）；对于治疗组（高表达neuritin+2型糖尿病组、高表达neuritin+2型糖尿病+二甲双胍、2型糖尿病+二甲双胍组），骨髓CD31阳性面积有明显提高，提示其骨髓的血管密度大于2型糖尿病（P<0.05）(见图5A，5B)。5.3 小鼠骨髓交感神经病变 用交感神经纤维抗体：儿茶酚胺酶酪氨酸羟化酶（TH）染色骨髓，来评估各组小鼠交感神经病变情况。与正常对照db/m

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文48图5 各组模型鼠骨髓微血管病变程度和交感神经病变程度的比较。（A）激光共聚焦IF图片显示各组小鼠股骨的CD31（红）、TH（绿）、核（DAPI）染色率，比列尺：50mm；（B）对各组小鼠股骨CD31阳性区域的定量分析；（C）对各组小鼠股骨TH阳性的区域定量分析；与正常组相比**P <0.01，与2型糖尿病组相比##P <0.01。IF：免疫荧光。Figure 5. The comparison of the degree of microvascular lesions and sympatheticneuropathy in the bone marrow in each group. (A) Representative examples of highmagnification confocal IF images showing staining of CD31 (red), TH (green), nuclear(DAPI) in bone marrow in each group. Scale bar: 50 mm. (B) Quantitative of positive regionof CD31 red of femur. (C) Quantitative of positive region of TH green of femur.**P <0.01vscontrol group,##P <0.05 vs type 2 diabetes group.5.4 表达CXCR4-骨髓细胞的迁移与SDF-1的浓度水平密切相关前研究表明，在疾病条件下CXCR-4/SDF-1介导细胞的迁移与受损组织高度相关[47.48]，因此，我们检测在骨髓中是否CXCR4-细胞（CXCR4表达的细胞）与SDF-1相关。通过SDF-1α和CXCR4的IF染色，结果表明在2型糖尿病小鼠骨髓中，CXCR4-细胞的分布与SDF-1α高度相关，并且部分免疫反应显示CXCR4与SDF-1α存在共定位（见图6）。我们进一步确认SDF-1的免疫活性处在细胞

图6 2型糖尿病可以诱导骨髓SDF-1增强CXCR4阳性细胞的动员。激光共聚焦IF图片显示各组小鼠股骨的CXCR4（红）、SDF-1α（绿）、核（DAPI）染色，比列尺：50mm。Figure 6. Type 2 diabetes can induced SDF-1 elevation recruits CXCR4-positive cells inbone marrow. Representative examples of high magnification confocal IF images showingstaining of CXCR4 (red), SDF-1(green), nuclear (DAPI) in bone marrow in Control , in T2DA/Lyz-Cre+T2D. Scale bar: 50 mm.6 小鼠骨髓neuritin表达通过免疫荧光检测各组小鼠骨髓neuritin的表达量。相比于正常对照db/m小鼠，2型糖尿病组小鼠的neuritin表达量显著降低, 高表达neuritin+db/m小鼠组的neuritin表达量显著（P<0.05）；高表达neuritin+2型糖

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本文编号：2828647