氟中毒对SH-SY5Y细胞NMDA受体蛋白亚单位及其磷酸化的影响

发布时间：2020-10-08 22:16

　　目的:体外培养SH-SY5Y细胞,应用N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的非竞争性拮抗剂地卓西平(dizocilpine,MK-801)作为保护神经的工具药,通过检测细胞活性、细胞凋亡、细胞内Ca2+荧光、NMDA受体亚基蛋白及其磷酸化蛋白的表达,探讨在氟中毒引起神经系统的损伤中NMDA受体参与的机制。方法:体外培养SH-SY5Y细胞,用不同浓度的Na F和MK-801对细胞进行干预处理,将细胞分为六组:(1)正常对照组;(2)低氟组(0.2mmol/L Na F);(3)高氟组(2mmol/L Na F);(4)拮抗剂对照组(10μmol/L MK-801);(5)低氟拮抗剂组(0.2mmol/L Na F+10μmol/L MK-801);(6)高氟拮抗剂组(2mmol/L Na F+10μmol/L MK-801)。CCK-8法检测细胞增殖活性,筛选出Na F和MK-801的合适用药浓度;Fluo-3-AM细胞内钙离子荧光染色检测细胞内Ca2+的浓度;采用Annexin V-FITC和PI双染色法,用流式细胞仪测定细胞凋亡率;western blot法检测NMDA受体各亚单位蛋白NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B及相应phospho-NMDAR1、phospho-NMDAR2A和phospho-NMDAR2B的表达。运用SPSS 22.0软件统计分析结果。结果:1.Na F对SH-SY5Y细胞的损伤程度呈浓度和时间依赖性,最终低氟选用Na F浓度为0.2mmol/L,高氟选用Na F浓度为2mmol/L,MK-801用药浓度为10μmol/L。2.细胞内Ca2+浓度结果:与对照组比较,低氟和高氟组细胞内Ca2+平均荧光值均明显增加,差异有统计学意义,加入MK-801后高氟组细胞内Ca2+平均荧光值均明显减弱(P均小于0.05)。3.细胞凋亡结果:与对照组比较,低氟组中细胞凋亡率无明显变化,加入MK-801后也无变化趋势。高氟组的细胞凋亡率明显升高,高氟组细胞使用MK-801后凋亡率有所下降(P0.05)。4.NMDA蛋白表达:与对照组比较,高氟组NMDAR1、NMDAR2A、phospho-NMDAR1、phospho-NMDAR2B蛋白表达量上调(P0.05)。这些上调表达可以被MK-801逆转。结论:NMDA受体参与过量氟暴露致神经系统损伤的机制,可能是通过NMDA受体亚基磷酸化,使得NMDA受体过度活化,Ca2+大量内流,导致神经细胞发生凋亡和坏死。
【学位单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R595
【部分图文】：

蛋白标准曲线

存活率,作用时间,细胞存活率,浓度

同作用时间 SH-SY5Y 细胞的活性情况，其结果如图 2-1 所示：低.24mmol/L）对 SH-SY5Y 细胞有轻微的促进生长作用，但随着氟浓，细胞的存活率随之减低，呈反比关系；高浓度的氟作用 36h 和 48活率的降低较作用 12h 和 24h 更加显著。当 NaF 浓度为 2mmol/L时 SH-SY5Y 细胞的存活率约为 75%，作用 24 小时细胞存活率约6 小时细胞存活率约为 23%，作用 48 小时细胞存活率约为 19%。 24 小时作为最佳药物刺激时间，2mmol/L 的 NaF 作为高氟组，相mmol/L 的 NaF 作为低氟组。

荧光染色,细胞内

如图 2-2、图 2-3 所示，SH-SY5Y 细胞内钙离子经荧光探针 fluo3-AM 染色后，使用荧光显微镜观察细胞内 Ca2+表达情况发现：与对照组比较，低氟组中SH-SY5Y 细胞内 Ca2+（绿色荧光）表达信号增强；而高氟组中 SH-SY5Y 细胞数目减少，细胞变圆，但细胞内 Ca2+荧光颜色更深，呈亮绿色荧光；与单独高氟组相比较，加入抑制剂 MK-801 后，Ca2+荧光强度趋势明显减弱。

【相似文献】