橙皮素对百草枯中毒大鼠肺组织损伤保护作用的实验研究

发布时间：2020-10-09 04:21

　　【研究目的】通过测定百草枯中毒大鼠肺组织氧化应激水平、细胞因子水平以及TGF-β1/Smad信号通路关键蛋白表达的变化情况,探讨橙皮素干预对百草枯所致大鼠肺损伤的保护作用及可能的作用机制。【研究方法】将140只Wistar雄性大鼠随机分为阴性对照组、橙皮素对照组、百草枯模型组、吡非尼酮对照组、橙皮素低、中、高剂量治疗组,每组20只。阴性对照组和橙皮素对照组不染毒,其他各组均以50mg/kg百草枯一次性灌胃染毒,建立大鼠百草枯致大鼠肺纤维化动物模型。染毒24小时后对各组分别给予相应药物干预,每天灌胃给药一次。大鼠染毒后第7d、28d每组随机处死10只大鼠,随机选其中3只大鼠取其肺组织行HE、Masson染色,观察比较不同时间点各组大鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化病变程度;应用碱水解法测定不同时间点各组大鼠肺组织匀浆液中羟脯氨酸(HYP)含量,判断肺组织胶原纤维沉积情况;采用各指标试剂盒检测不同时间点各组大鼠肺组织中丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和总抗氧化能力(T-AOC)活力;采用酶联免疫法(ELISA)检测不同时间点各组大鼠肺组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)的水平;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定染毒后不同时间点各组大鼠肺组织中Smad2/3和Smad7 mRNA表达水平变化情况,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定染毒后不同时间点各组大鼠肺组织中Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表达水平变化情况。应用SPSS 22.0统计软件对计量资料及病理半定量资料结果进行分析。【研究结果】1.动物一般情况阴性对照组和橙皮素对照组大鼠饮食、活动状况正常,毛发光滑;模型组大鼠饮食量减少,毛发干枯稀疏,精神萎靡不振,部分大鼠出现腹泻现象,体重较阴性对照组生长缓慢,部分大鼠呼吸困难并伴有湿锣音,于造模后第2天死亡1只。吡非尼酮对照组大鼠饮食较为正常,毛发尚可,体重增长良好,于造模后第11天死亡1只。橙皮素低剂量治疗组大鼠毛发略有干枯现象,饮食较阴性对照组有所减少,体重增长较为缓慢。橙皮素中、高剂量治疗组大鼠毛发尚可,饮食和体重增长情况较为正常,呼吸困难症状有所减轻,精神状态良好。2.组织病理学检查百草枯染毒7d后大鼠肺组织病理学检查发现百草枯模型组大鼠出现以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润,部分组织结构遭到破坏;经吡非尼酮和橙皮素治疗后,大鼠肺组织炎性浸润程度有所减少,肺泡结构更完整;百草枯染毒28d后大鼠模型组肺组织肺泡炎减少,胶原纤维沉积明显增多,肺纤维化程度加重,经吡非尼酮和橙皮素治疗后大鼠肺组织纤维化程度均有所减轻。大鼠肺泡炎半定量分析结果显示,百草枯模型组肺泡炎评分较正常对照组有显著升高(P0.01),治疗后第7d、28d吡非尼酮对照组和橙皮素各剂量治疗组肺泡炎评分较模型组有不同程度的降低(P0.05,P0.01)。百草枯模型组第28d肺纤维化评分较正常对照组显著升高(P0.01),吡非尼酮对照组和橙皮素各剂量治疗组第28d肺纤维化评分较PQ模型组有不同程度的降低(P0.05,P0.01)。3.各组大鼠肺组织中MDA、SOD、CAT、GSH-PX和T-AOC水平变化阴性对照组与橙皮素对照组大鼠肺组织中各氧化指标水平之间无统计学差异(P0.05);与阴性对照组比较,百草枯染毒后模型组大鼠肺组织中MDA水平显著升高(P0.01),SOD、CAT和GSH-PX活力明显降低(P0.05)。经吡非尼酮和橙皮素干预后MDA水平明显降低(P0.05,P0.01),SOD、CAT和GSH-PX活力出现不同程度的升高(P0.05,P0.01)。4.各组大鼠肺组织中TGF-β1、IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平变化阴性对照组与橙皮素对照组大鼠肺组织中各炎性指标水平之间无统计学差异(P0.05);与阴性对照组比较,百草枯染毒后模型组大鼠肺组织中TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10水平均显著升高(P0.01),IFN-γ水平无显著性差异(P0.05);经吡非尼酮和橙皮素干预后炎性因子水平较模型组明显降低(P0.05,P0.01),抗炎因子水平有所升高(P0.05,P0.01)。5.各组大鼠肺组织中Smad2/3和Smad7 mRNA表达变化情况阴性对照组与橙皮素对照组大鼠肺组织中各指标水平之间无统计学差异(P0.05);与阴性对照组比较,百草枯染毒后模型组大鼠肺组织中Smad2/3 mRNA表达水平在两个时间点均有显著升高(P0.05,P0.01),而Smad7 mRNA表达水平有下降趋势,于纤维化形成期差异更为明显(P0.05);经吡非尼酮和橙皮素干预后Smad2/3 mRNA表达水平较模型组明显降低(P0.05,P0.01),Smad7 mRNA表达水平较模型组明显升高(P0.01)。6.各组大鼠肺组织中Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表达变化情况大鼠染毒后第7d、28d橙皮素对照组大鼠肺组织中Smad2、P-Smad2/3蛋白表达水平较阴性对照组无统计学差异(P0.05),大鼠染毒后第7d橙皮素对照组大鼠肺组织中Smad3蛋白表达水平较阴性对照组有所升高(P0.05),而染毒后第28d橙皮素对照组大鼠肺组织中Smad3蛋白表达水平较阴性对照组有所降低(P0.05),大鼠染毒后两个时间点橙皮素对照组大鼠肺组织中Smad7蛋白表达水平较阴性对照组明显升高(P0.05,P0.01)。百草枯模型组大鼠肺组织中Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达水平较阴性对照组均有所升高(P0.01),Smad7蛋白表达水平较阴性对照组有所降低(P0.01);经治疗后第7d吡非尼酮对照组和橙皮素各剂量治疗组大鼠肺组织中Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达水平较模型组均有不同程度的下降(P0.05,P0.01),而经治疗后第7d大鼠肺组织中Smad7蛋白表达水平较百草枯模型组显著增加(P0.01),第28d吡非尼酮对照组大鼠肺组织中Smad7蛋白表达水平较百草枯模型组显著增加(P0.01),橙皮素各剂量治疗组高鼠肺组织中Smad7蛋白表达水平较百草枯模型组差异不显著(P0.05)。【研究结论】1.百草枯中毒可导致大鼠体内氧化-抗氧化状态失衡,继而损伤肺组织。橙皮素能够抑制百草枯中毒大鼠肺组织中氧化因子水平,提高抗氧化因子水平,从而减轻百草枯对肺组织的损伤作用;2.橙皮素可抑制百草枯中毒大鼠肺组织中炎性因子的释放,并促进分泌抗炎因子,从而减轻百草枯对肺组织的损伤作用;3.橙皮素能够抑制致百草枯中毒大鼠肺组织中纤维化因子TGF-β1的合成与分泌,降低百草枯中毒大鼠肺组织中Smad2/3 mRNA和蛋白及p-Smad2/3蛋白表达水平,提高Smad7 mRNA和蛋白表达水平,从而阻断TGF-β1/Smad信号通路,减轻肺组织损伤;4.结合肺组织病理学研究发现,百草枯中毒大鼠肺组织损伤随橙皮素剂量增大而减轻,提示橙皮素有待成为治疗百草枯中毒的新药物,为今后指导橙皮素的开发及应用于临床提供了可靠的药理学依据。
【学位单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R595.4
【部分图文】：

标准曲线,试剂盒,标准曲线,大鼠

橙皮素对百草枯中毒大鼠肺组织损伤保护作用的实验研究。内液体清除，用洗涤液将各孔注满，15s 后甩干，洗涤 5 次后可用。按同样顺序向各孔加入 100μl TMB Substrate Solution，置于室温（min，每孔加入 100μl 终止液。酶标仪波长为 450nm 处检测各孔 OD 值，检测要在终止反应的 1 Curve Expert 1.4 专业作图软件，作出 TGF-β1 标准曲线图和回归浓度时可将样品 OD 值代入方程式，所得浓度乘以样品稀释倍数即，标准曲线见图 5。-128.682750.28x-768.482y x

标准曲线,ELISA试剂盒,标准曲线

图 6 大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒标准曲线组织中 IL-4 测定（ELISA 法）原理准品中的大鼠IL-4抗原结合相对应的抗体，洗板后加入HRP酶标的酶与底物发生显色反应，可通过检测固定好酶的含量推算出样定量分析。配制试剂配制步骤。步骤盒中所有试剂置于室温至少 30min，严格按照说明书对各试剂进标板，确定 7 个标准孔、2 个空白孔和样品孔，用洗涤液将各孔

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器吸取 0.06ml Streptavidin-HRP，加入 11.94ml 配好的缓冲液，混孔加入 100μl Streptavidin-HRP，贴上封膜，置于室温（18~25℃）液体清除，用洗涤液将各孔注满，15s 后甩干，洗涤 3 次后用吸同样顺序向各孔加入 100μl TMB Substrate Solution，置于室温（in，每孔加入终止液 100μl。标仪波长为 450nm 处检测各孔 OD 值，检测要在终止反应的 10Curve Expert 1.4 专业作图软件，作出 IL-4 标准曲线图和回归方程可将样品 OD 值代入方程式，所得浓度乘以样品稀释倍数即为样线见图 7。

【参考文献】