下调乙酰辅酶A羧化酶2调节自噬可改善棕榈酸诱导的肾小管上皮细胞脂毒性
发布时间：2020-10-09 08:18
目的：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的并发症之一,它已经成为引起终末期肾病(end-stage renal disease ESRD)的主要原因。在非脂肪组织中,脂质超负荷会使循坏和胞质中的脂质分解和合成平衡紊乱,发生了脂质的异常堆积,这被称之为脂毒性。研究证明脂毒性与很多代谢综合征的病理生理学机制相关,特别是2型糖尿病(T2DN)及其并发症。β-氧化是脂肪酸分解代谢的主要途径且为肾脏ATP产生的主要来源。乙酰辅酶A羧化酶2(Acetyl-CoA carboxylase 2, ACC2)是脂肪酸代谢的关键酶并催化乙酰辅酶A羧化为丙二酰辅酶A,而丙二酰辅酶A是脂肪酸氧化的一个关键代谢产物,通过抑制肉碱棕榈酰转移酶I(CPTI)来限制脂肪酸β氧化,是脂肪酸代谢的关键酶。自噬因能控制细胞能量平衡而被熟知。但是自噬与脂肪酸β氧化两者相互间的关系仍然未知。本研究旨在探讨：ACC2在棕榈酸(palmitic acid, PA)诱导人肾小管上皮细胞脂毒性中的作用和自噬在这个过程中可能起到的作用。方法：1.用300 uM棕榈酸处理HK2细胞特定的时间,并以BSA作为对照组。用油红O染色观察细胞内脂质的沉积。用CCK-8来观察细胞活性。用PI染色来观察细胞死亡情况。2.用qPCR的方法观察：棕榈酸及BSA分别刺激HK2细胞后ACC2的nRNA水平。用免疫组化的方法观察：高脂喂养的大鼠与正常喂养大鼠ACC2和pACC2的表达水平。3.使用shRNA慢病毒感染HK2细胞使ACC2的表达发生变化,并用VesrernBlot方法来验证敲除效率,之后用300 uM PA处理转染HK2细胞72小时。用油红O染色观察细胞内脂质的沉积。用CCK-8来观察细胞活性。4.PA处理HK2细胞后观察自噬表达水平。不同浓度PA刺激HK2细胞2小时后,用Western blotting检测LC3, Beclin-l and p62,用透射电镜以及mRFP-GFP-LC3腺病毒干扰的方法检测HK2细胞的自噬情况。5.用Western Blot、RT-qPCR及免疫组化的方法检测高脂饮食大鼠以及正常喂养大鼠体内LC3, Beclin-1 和 p62的表达水平。6.改变p-氧化后观察自噬改变情况。分别用ACC2kd (ACC2 shRNA knockdown, ACC2kd)细胞及80 uM Etomoxir处理HK2细胞后观察自噬。用Western Blot检测LC3, Beclin-1 和 p62蛋白水平。用LC3免疫荧光的共聚焦显微镜来观察各组自噬的改变情况。7.使用户Ltg5 siRN A感染HK2细胞,使Atg5表达降低,并用Wesrern Blot方法验证敲除效率。分别用PA刺激ACC2 D的HK2细胞、Atg5KD的HK2细胞以及两者共同敲除的HK2细胞,使用CCK8的方法观察细胞活性。结果：1.在PA刺激24h观察到HK2细胞内脂质沉积,随着时间的增长呈现时间依赖性。细胞活性在PA处理(P0.05)后48小时下降明显,72小时进一步降低。PA刺激HK2细胞死亡明显。2.用qPCR检测PA刺激HK2细胞,ACC2的mRNA(P0.05)水平比正常HK2细胞明显增高。高脂喂养大鼠相比正常喂养大鼠,前者ACC2表达升高且pACC2表达明显降低。3.ACC2kd细胞在PA刺激72小时后脂质沉积明显减少且细胞活性(P0.05)较单纯PA刺激的HK2细胞也有明显改善。4.检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62蛋白表达均表明：PA刺激HK2细胞时,自噬从最低浓度100 uM PA刺激时被激活,并呈现浓度依赖性(P0.05)。透射电镜及mRFP-GFP-LC3的腺病毒感染也得出相同结论。5.无论在蛋白水平还是mRNA水平,高脂喂养大鼠相比正常喂养大鼠,自噬都被激活。6.ACC2kd细胞降低了PA刺激后自噬(P0.05)的水平。7.PA刺激HK2细胞,ACC2或Atg5基因沉默组HK2细胞活性与单纯PA刺激的细胞相比,基因沉默组细胞活性有所恢复,但是双基因的沉默并没有使细胞活性有更加显著的恢复。结论：在体内、外实验中脂质代谢功能障碍时自噬被激活。体外实验中,通过下调乙酰辅酶A羧化酶2水平调节自噬可改善由棕榈酸诱导的肾小管上皮细胞的脂毒性。根据目前的研究表明,ACC2调节自噬的活动,这提供了PA诱导的肾脂毒性一种新型的分子机制。这些信号通路的药物靶向可能有助于设计出一种新的方式预防代谢综合征时肾功能恶化的治疗策略。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：
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本文编号：2833463
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：
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