Fmr1敲除小鼠大脑皮层蛋白质组和磷酸化组及FXS发病机制的研究

发布时间：2020-10-12 03:40

　　 脆性 X 染色体综合征(Fragile X mental retardation Syndrome,FXS)是一种最常见的遗传性精神发育迟滞疾病。FXS在男性中发病率为1/4000,女性中发病率为1/6000。其主要症状表现为认知和行为缺陷、智力低下、语言学习和交流障碍,长脸、大耳、睾丸巨大。部分病人表现出自闭症(autism)的症状。FXS的发病原因是位于位于X染色体上Xq27位点的基因Fmrl(Fragile X mental retardation gene 1)的5'端非编码区出现多于200 bp CGG三核苷酸重复性突变,相邻的CpG岛高甲基化,导致Fmrl基因表达关闭和编码蛋白FMRP缺失。FXS的病理改变主要是大脑皮层神经元的树突棘密度增加,形态更为细长和弯曲,缺少成熟的蘑菇样树突棘。由FXS导致的智力障碍给病人带来巨大的痛苦,患者从出生到生命结束这一漫长的病程给家庭和社会带来极其沉重的负担。目前仅有少数几种药物可用于改善部分症状。虽然有多种小分子化合物进入临床试验,但结果并不理想,其核心症状依然无药可治。大量研究表明在FXS病人外周组织和Fmrl KO小鼠神经元中多种激酶所介导的细胞磷酸化信号转导功能紊乱。FMRP蛋白的缺失引起神经元多种激酶信号通路异常,而且多表现在磷酸化水平的增加。此外,FMRP可能参与DNA损伤修复,有报导Fmrl敲除促进精母细胞的凋亡。FMRP是一个mRNA结合蛋白,主要起翻译抑制作用(调控新蛋白合成)。在基因组和转录组的水平利用Fmrl KO小鼠对FMRP结合哪些mRNA,调控哪些mRNA的翻译,维持哪些mRNA的稳定性有过—系列的研究。发现FMRP主要结合在接近900个靶点蛋白mRNA的编码区。这些蛋白质包括突触前、后蛋白和与自闭症候群相关的蛋白,提示FXS发病与调控突触蛋白翻译紧密相关。研究蛋白质的翻译(即蛋白质合成)可能为揭示FXS病理机制提供帮助。液相色谱-高分辨质谱联用为基础的蛋白组学技术将复杂的组织、细胞蛋白提取物利用胰酶降解为多肽复合物,再用液相色谱-质谱联用/二级质谱分析的方法得到多肽的二级谱图,结合完备的蛋白质序列数据库解析多肽序列,进而大规模地鉴定特异蛋白质。本实验收集了 Fmrl野生型和敲除小鼠大脑皮层,利用基于超滤辅助的样品制备方法,结合串联质量标签标记方法和高pH的反向色谱分离,结合高压液相色谱质谱连用分析获得大规模的定量蛋白质组数据。同时再利用二氧化钛纳米颗粒富集磷酸化多肽并用Motif X数据库预测了磷酸化位点的特征。利用磷酸化特异性抗体和靶向质谱的手段对结果进行验证,构建模拟磷酸化和模拟磷酸化缺失的突变体导入Hela细胞和神经细胞系中,用激光共聚焦显微镜观察其定位情况。再引入诱导凋亡的胁迫处理,分析应激条件下磷酸化的作用。FMRP通过结合靶蛋白mRNA进而调控蛋白质的合成。本实验利用甲硫氨酸类似物叠氮同型丙氨酸(AHA)标记新合成蛋白质,用基于叠氮-炔反应的化学生物学方法直接富集新蛋白质,再用质谱检测并定量新合成的蛋白质。本实验结果表明小鼠大脑皮层中,共鉴定了 4927个蛋白,上调蛋白56个,下调蛋白36个。这些差异表达蛋白主要富集突触上,主要与RNA结合、细胞器组装及细胞压力调节等通路相关。磷酸化水平上,共鉴定磷酸化位点7696个,其中上调139个,下调2个,这些差异磷酸化位点主要富集在细胞骨架蛋白结合、actin结合等通路上。通过Motif-X分析归纳出...SP...,..TP...,..RxxS..等基序。我们优化了靶向质谱的方法,验证了其准确度和重复性,在此基础上验证了蛋白质组部分蛋白上调的结果。PRKRA模拟磷酸化和模拟磷酸化缺失突变体在基态下不影响其定位,并且与FMRP有共定位。压力胁迫下,PRKRA模拟磷酸化突变体促进细胞凋亡,PRKRA模拟磷酸化缺失突变体减少细胞凋亡。甲硫氨酸类似物叠氮同型丙氨酸(AHA)可以用于标记新合成蛋白质,鉴定到新合成蛋白。这些新合成有差异的蛋白可能是FMRP的潜在靶蛋白。综上,本研究大规模定量分析了 Fmrl敲除小鼠大脑皮层蛋白质组和磷酸化组的变化,并验证了其中部分结果。构建了模拟磷酸化和磷酸化缺失的突变体,发现PRKRAS18磷酸化促进细胞凋亡,PRKRAS18A减少细胞凋亡。针对FMRP调控蛋白质合成的特点,开发了非天然氨基酸参入,靶向富集新合成蛋白的方案,成功富集到新合成蛋白。这些成果扩大了对FXS疾病的认知程度,为FXS疾病提供了潜在的分子靶标,并为其治疗提供了一定的依据。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R596.1
【部分图文】：

图 1-1 FMR1 基因第一号外显子的 CGG 重复序列数目与疾病相关性[8]正常人有 6 到 50 个 CGG 重复，并且是非甲基化的。脆性 X 携带者有 50 到 200 个 CGG 重复序列，并且是非甲基化的，FMRP 蛋白有表达。脆性 X 染色体综合征患者有大于 200 个 CGG 重复序列，并且是甲基化的，FMRP 蛋白表达降低。1.2 FMRP 蛋白1.2.1 FMRP 蛋白结构FMRP 蛋白包含 N 端结构域、KH1、KH2 结构域和 C 端结构域。其中 N 端结构域上包含核定位信号 NLS。KH 结构域负责结合 RNA，其中 KH2 结构域上第

图 1-2 FMRP 蛋白结构 [8]FMRP 是一个 RNA 结合蛋白，纯化的的 FMRP 具有结合 RNA 的能力[9]。核糖体与蛋白形成 FMRP-mRNP 复合体。有假说认为，当 FMRP 缺失的时候，正处于 FMRP-mRNP 复合体中的 mRNA 翻译会受到影响，继而导致认知缺陷[10]。为了鉴定与内源性的 FMRP 有相互作用的 mRNA，首先开发了一款特异的针对FMRP 蛋白的抗体，流程是用鼠的 FMRP 蛋白免疫 FMRP 敲除的小鼠。得到的抗体分别用于免疫沉 WT 和 KO 的小鼠脑裂解液，IP 下来的 mRNA 经过反转录成cDNA，再用芯片杂交。 该芯片包含了 UniGene 数据库的 19,201 个 mRNA，并用 RT-PCR 验证了芯片的结果。此后，又开发了基于光交联的方法[11]。FMRP亚型 1 和亚型 7 结合了大约 80,000 个位点，其中超过 85%的位点能够覆盖到约6,000 个 mRNA。FXR1P 和 FXR2P 蛋白的结合位点与 FMRP 的结合位点相比较，

华东师范大学博士学位论文1.5 蛋白质组学蛋白质组学的最初目标是鉴定蛋白质。其中应用最广泛的方法是“自底向上”的策略。基本流程是用酶将蛋白样品分解成多肽混合物。多肽经过分离后，在离子源发生电离带上电荷，进入质谱后，质谱仪记录质量电荷比和时间。采集后的数据经过数据处理，得到结果[35]。
【共引文献】

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本文编号：2837580