阿托伐他汀钙、雷洛昔芬对3T3-E1细胞增殖与分化影响的比较

发布时间：2020-10-13 03:56

　　 背景:成骨前体细胞3T3-E1细胞来源于新生小鼠颅骨、长干骨的细胞系,经过培养后可观察到肉眼可见的矿化结节,其中MC3T3亚克隆4和14培养后可形成矿化良好的细胞外基质,可证明3T3-E1细胞具有体外诱导分化为骨细胞的能力,是研究体外成骨细胞分化的经典模型。目前3T3-E1细胞被大量用作探讨成骨细胞分化相关机制的实验对象,曾有应用降糖药物、降低氧化应激药物及中药等对该细胞影响的研究,而调脂药物、雌激素受体调节剂相关的研究较少。目的:观察阿托伐他汀钙、雷洛昔芬对成骨前体细胞(3T3-E1)的增殖分化的作用,并比较两者对3T3-E1细胞增殖与分化的影响。方法:1.显微镜下观察成骨前体细胞3T3-E1形态结构和生长状态。2.3T3-E1细胞培养至对数期,设置对照组(不加入阿托伐他汀钙),实验组加入含不同浓度阿托伐他钙(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)的培养液继续培养细胞,24小时后利用CCK-8比色法观察阿托伐他汀钙对成骨前体细胞3T3-E1增殖能力的影响,测定吸光度值;继续取培养至对数生长期的成骨前体细胞3T3-E1,设置对照组,实验组加入不同浓度的雷洛昔芬(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)处理培养成骨前体细胞3T3-E1,24小时后使用CCK8试剂盒检测成骨前体细胞3T3-E1的增殖情况。3.3T3-E1细胞培养至对数期,设置对照组(不加入阿托伐他汀钙),实验组加入含不同浓度阿托伐他钙(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)的培养液继续培养细胞,24小时后利用碱性磷酸酶测定试剂盒测定碱性磷酸酶(ALP)活力,测定吸光度值;同样取培养至对数生长期的成骨前体细胞3T3-E1,分组同2,同样于24小时后使用碱性磷酸酶测定试剂盒测定ALP的活力,了解成骨前体细胞3T3-E1的分化情况。4.向3T3-E1细胞中加入对细胞增殖及分化作用最明显的10-6mol/L阿托伐他汀钙,干预细胞24小时后,用Trizol法提取细胞样本中总RNA,进行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测内质网应激信号通路标志性基因PERK、Bip、eIF2α的mRNA表达水平;同样选取培养至对数生长期的3T3-E1成骨前体细胞,加入对细胞增殖及分化作用最强的10-7mol/L雷洛昔芬,同时设置空白对照组,于24小时提取RNA,应用qRT-PCR检测细胞内PERK、Bip、eIF2α的mRNA的表达情况。5.3T3-E1细胞培养至对数期,设置对照组,实验组分别加入对3T3-E1细胞增殖与分化能力最强的10-6mol/L阿托伐他汀钙、10-7mol/L雷洛昔芬的培养液继续培养细胞,24小时后利用CCK-8比色法测定成骨前体细胞3T3-E1的吸光度值;3T3-E1细胞培养至对数期,设置对照组,实验组分别加入对3T3-E1细胞增殖与分化能力最强的10-6mol/L阿托伐他汀钙、l0-7mol/L雷洛昔芬的培养液继续培养细胞,24小时后利用碱性磷酸酶测定试剂盒测定碱性磷酸酶(ALP)活力;3T3-E1细胞培养至对数期,设置对照组,实验组分别加入对3T3-E1细胞增殖与分化能力最强的10-6mol/L阿托伐他汀钙、10-7mol/L雷洛昔芬的培养液继续培养细胞,24小时后应用qRT-PCR检测细胞内PERK、Bip、eIF2α的mRNA的表达情况。6.统计学处理:应用SPSS 21.0软件进行统计学处理,实验数据用均数±标准差(x±s)表示,各组间比较应用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P0.05为差异有统计学意义。结果:1.显微镜下观察体外培养的3T3-E1细胞为贴壁生长状态,呈现梭形、多角形及不规则形等形态,细胞有的伸出突起,具备成骨细胞系生长特性。2.不同浓度的阿托伐他汀钙(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)均可促进3T3-E1细胞增殖(P0.05),在一定浓度范围内随着阿托伐他汀钙干预浓度的增加,细胞增殖能力增强(P0.05),以阿托伐他汀钙(10-6mol/L)影响最显著;加入雷洛昔芬药物组与只加入培养液的空白对照组相比较,加入雷洛昔芬药物组可以促进成骨前体细胞3T3-E1的增殖(P0.05),在一定浓度范围内雷洛昔芬浓度增高,细胞增殖程度随之升高(P0.05),雷洛昔芬(10-7mol/l)促增殖能力最强。3.不同浓度的阿托伐他汀钙(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)干预细胞后,各组的ALP活性均增加,且以阿托伐他汀钙(10-6mol/L)升高ALP活性最明显(P0.05);加入药物雷洛昔芬组与空白对照组相比较,加入雷洛昔芬药物不同浓度处理后各组ALP活力均有所增加(P0.05),而且随雷洛昔芬不同浓度的变化而变化,并且雷洛昔芬组(10-7mol/l)升高ALP的活力较明显。4.终浓度10-6mol/L的阿托伐他汀钙干预3T3-E1细胞24小时,RT-PCR结果显示,3T3-E1 细胞 Bip、PERK、eIF2α基因 mRNA 表达均高于对照组(P0.05);10-7mol/L 的雷洛昔芬雷洛昔芬处理后的成骨前体细胞3T3-E1测定Bip、PERK、eIF2α的表达均升高(P0.05)。5.10-6mol/L阿托伐他汀钙与10-7mol/l雷洛昔芬干预3T3-E1细胞24小时,两组细胞OD值均较对照组升高,但两组间无统计学差异。6.阿托伐他汀钙、雷洛昔芬最适浓度干预3T3-E1细胞,与对照组相比,碱性磷酸酶明显升高,且阿托伐他汀钙较雷洛昔芬对3T3-E1分化的促进作用更显著(P0.05)。7.阿托伐他汀钙、雷洛昔芬最适浓度干预3T3-E1细胞,与对照组相比,Bip、PERK、eIF2α mRNA表达水平均升高(P0.05),实验组间比较,阿托伐他汀钙组Bip、PERK表达更明显(P0.05),而eIF2αmRNA的表达无统计学意义。结论:1.显微镜下观察雷洛昔芬作用于成骨前体细胞3T3-E1,其形态符合成骨细胞系的生长特征。2.阿托伐他汀钙和雷洛昔芬能够促进成骨前体细胞(3T3-E1)的增殖,并且在一定范围内随着浓度的升高,促进细胞增殖的能力愈明显。3.阿托伐他汀钙和雷洛昔芬能够增加成骨前体细胞(3T3-E1)的成骨活性能力,在一定浓度范围内,高浓度组的成骨活性能力高于相对低浓度组。4.mRNA水平,阿托伐他汀钙、雷洛昔芬能够上调内质网应激信号通路标志性基因PERK、Bip、eIF2α的表达,提示其促进3T3-E1细胞增殖分化的作用机制可能与内质网应激信号通路相关。5.阿托伐他汀钙及雷洛昔芬最适浓度对3T3-E1细胞增殖效果无明显差异,而阿托伐他汀钙对成骨活性及内质网应激标志物基因的表达影响优于雷洛昔芬。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：

复苏细胞并培养２４小时之后在显微镜下呈现分散的贴壁生长，生长状态良好，显微??镜下形态近似为梭形、多角形等，胞质丰富，胞核较大，胞浆内能观察到黑色颗粒，细??胞两端伸出突起，具备成骨细胞系生长特性。加入阿托伐他汀钙之后３Ｔ３－Ｅ１细胞的数量??及密度明显增加（图３．１．１）。??

２．１显微镜下观察成骨前体细胞３Ｔ３－Ｅ１及雷洛昔芬干预后的形态??加入完全培养基对照组与加入雷洛音芬药物实验组相比较，加入药物后成骨前体??细胞形态表现更明显，且数量及密度较加入雷洛昔芬药物之前明显增加（图３．２．１）。??
【参考文献】

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本文编号：2838702