第一部分GLP-1RA促进C3H10T1/2骨髓间充质干细胞分化为成熟棕色脂肪细胞目的:研究表明胰高糖素样肽1-受体激动剂(GLP-1RA)通过促进白色脂肪细胞棕色化而减轻体重,该基础实验旨在研究GLP-1RA(利拉鲁肽)对C3H10T1/2骨髓间充质干细胞分化为成熟棕色脂肪细胞的影响,并研究信号通路PI3K/AKT/mTOR在细胞分化过程中所起的作用。方法:将C3H10T1/2骨髓间充质干细胞诱导分化为成熟的棕色脂肪细胞,从诱导细胞分化开始,使用利拉鲁肽(10nM,100nM)和(或)PI3K抑制剂10μmol LY294002干预至第8天,无利拉鲁肽及(或)LY294002干预为对照组,使用Annexin V法测细胞凋亡、CCK8法测细胞增殖,采用油红O染色进行脂肪细胞脂滴染色并测OD值,使用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测棕色脂肪细胞特异性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及线粒体功能相关基因(CytoC,COX II),mtDNA的表达,使用Western Blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路在分化过程中的蛋白定量变化。结果:1.与对照组比,棕色脂肪细胞的细胞凋亡随着利拉鲁肽干预浓度增加而下降(P0.05),细胞增殖则逐渐上升(P0.05),10nM利拉鲁肽作用使细胞分化第4,6,8天多腔脂滴形成及油红O染色定量显著多于对照组(P值均小于0.05),100nM利拉鲁肽使细胞分化第2,4,6,8天多腔脂滴形成及油红O染色定量显著多于对照组(P值均小于0.05)。2.在细胞分化过程中,棕色脂肪细胞特异性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及线粒体功能相关基因(CytoC,COX II),及mtDNA的表达在利拉鲁肽干预下显著高于对照组,且随着利拉鲁肽干预浓度的增加表达量逐渐提高(P值均小于0.05)。3.在棕色脂肪细胞分化过程中,利拉鲁肽干预下脂肪细胞的磷酸化AKT及mTOR蛋白定量水平逐渐增加,与对照组比具有统计学意义(P值均小于0.05),且于分化第8天100nM利拉鲁肽组磷酸化AKT及mTOR蛋白定量水平显著高于10nM利拉鲁肽组及对照组(P值均小于0.05)。4.在LY294002作用下,与对照组比,C3H10T1/2骨髓间充质干细胞分化为棕色脂肪细胞的数量减少,油红O染色定量显著下降,且棕色脂肪细胞特异性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及线粒体功能相关基因(CytoC,COX II),mtDNA,磷酸化AKT及mTOR蛋白定量水平均显著降低(P值均小于0.05)。5.当利拉鲁肽及LY294002共同作用于细胞分化过程时,与100nM利拉鲁肽干预组相比,油红O染色定量,棕色脂肪细胞特异性基因(PRDM16,PPARγ,PGC-1α,CIDE-A,UCP-1)及线粒体功能相关基因(CytoC,Cox II),mtDNA,磷酸化AKT及mTOR表达水平均显著下降或降低(P值均小于0.05)。结论:在C3H10T1/2骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化过程中,GLP-1RA不仅能抑制细胞凋亡、促进细胞增殖,也促进C3H10T1/2骨髓间充质干细胞分化过程中多腔脂滴的形成,且能促进C3H10T1/2骨髓间充质干细胞分化为成熟棕色脂肪细胞,另外,信号通路PI3K/AKT/mTOR在GLP-1RA介导的促分化过程中起到重要作用。第二部分GLP-1RA对腹型肥胖2型糖尿病患者脂肪分布及胰岛β细胞功能的影响目的:与西方人群相比,大多数中国2型糖尿病患者BMI并不高,然而却表现出腹型肥胖的特征。既往研究显示GLP-1RA能有效地控制肥胖2型糖尿病患者的血糖及体重,保护胰岛β细胞功能,减少内脏及肝脏脂肪沉积。本研究旨在研究GLP-1RA(艾塞那肽)对腹型肥胖的2型糖尿病患者的脂肪分布及胰岛β细胞功能的作用。研究方法:对49名腹型肥胖2型糖尿病患者进行24周的治疗干预,在干预前、干预后检测2型糖尿病患者体重、腰围、体质指数(BMI)、收缩压、舒张压、空腹血糖(FPG)、餐后2小时血糖(2h PBG)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、血脂、肝功能、肾功能、成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)、100g馒头餐试验,使用磁共振成像(MRI)测量皮下脂肪组织(SAT)及内脏脂肪组织(VAT)、氢质子磁共振波谱(1H-MRS)测量肝脏脂肪含量(LFC),以Matsuda指数(总体胰岛素敏感性指数)及MBCI指数(李-Bennett胰岛B细胞功能指数)评估胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能,使用配对t检验,Wilcoxon检验及秩和检验,控制年龄及性别的混合效应模型,Pearson相关性分析等统计方法进行统计分析。结果:1.共40名2型糖尿病患者最终完成24周的治疗和随访,所有2型糖尿病患者干预前、后空腹血糖为(9.14±2.41 mmol/L vs 8.01±2.03 mmol/L)、餐后2小时血糖为(15.95±4.28 mmol/L vs 14.38±3.37 mmol/L)、糖化血红蛋白为(8.43±1.06%vs 7.05±1.04%),干预后血糖水平均较干预前显著下降(P值均小于0.05)。2.与治疗前相比,2型糖尿病患者在艾塞那肽治疗干预后Matsuda指数无显著变化,而MBCI指数则升高明显(5.44±3.33 vs 7.27±5.04)(P=0.045)。3.艾塞那肽干预治疗前、后,受试者体重为(68.08±9.28 kg vs 64.53±10.41 kg),腰围为(88.83±5.58 cm vs 84.21±6.57 cm),BMI为(23.99±1.2 kg/m~2 vs 22.68±1.68 kg/m~2),治疗24周后与治疗前相比均下降显著(P均小于0.01)。4.治疗前、后受试者内脏脂肪面积为(80.56±34.26 cm~2vs 66.82±30.07 cm~2)、LFC为(22.96±3.02%vs9.83±2.38%)、SAT为(129.85±43.73 cm~2vs 114.18±44.39 cm~2),24周艾塞那肽治疗后均显著下降(P值均小于0.01)。5.FGF-21与干预治疗前相比,除在干预后显著下降外(372.79±244.56 pg/ml vs 198.64±147.02 pg/ml)(P0.01),也与肝脏脂肪含量均呈正相关(r=0.248,P=0.027)。结论:艾塞那肽不仅能有效地控制腹型肥胖2型糖尿病患者的血糖及体重,也能改善患者胰岛β细胞功能,减少内脏及皮下脂肪组织、肝脏脂肪含量。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：
南京医科大学博士学位论文结 果1 利拉鲁肽抑制棕色脂肪细胞的细胞凋亡、促进细胞增殖，促进多腔脂滴的形成采用流式细胞仪（Annexin V 法）测棕色脂肪细胞分化第 8 天的细胞凋亡，在利拉鲁肽（10nM，100nM）干预下，随着利拉鲁肽干预浓度的增加，细胞凋亡率逐渐下降（P 值均小于 0.05）（图 1A，图 1B）。
南京医科大学博士学位论文第 6 日、第 8 日逐渐增长；然而在 100nM 利拉鲁肽作用下，细胞的油红 O 染色定量在第 2 日明显增加（图 2B）。而在棕色脂肪细胞分化过程中，无论是对照组亦或是 10nM 利拉鲁肽干预组，多腔脂滴于分化第 4 日出现，而在 100nM 利拉鲁肽干预下，在分化第 2 日多腔脂滴已开始形成，而在分化第 8 日无论是 10nM利拉鲁肽或是 100nM 利拉鲁肽干预组，多腔脂滴的形成数量均明显多于对照组，提示利拉鲁肽显著地促进了棕色脂肪细胞多腔脂滴的形成（图 2C）。
（Pparγ），PR结构域蛋白16（Prdm16），Pgc-1α在细胞分化的第4日、第6日及第8日均增加明显（P < 0.05），其中，Pparγ增加约2.6倍，Prdm16增加约1.6倍，而Pgc-1α则增加约2倍（图3A）。而在100nM利拉鲁肽干预下，与对照组相比，细胞死亡诱导的DFFA样效应因子A（Cide-a）在细胞分化第2日及第4日无明显差异，然而，两组间的差异在分化第6日及第8日均具有统计学意义（P < 0.05），且在分化第8日，100nM利拉鲁肽干预组Cide-a的RNA表达水平高于对照组2.7倍（图3A）。此外，在细胞分化末期，100nM利拉鲁肽干预组的Ucp1基因表达水平明显高于10nM利拉鲁肽干预组及对照组（P < 0.05）（图3A）。图 3 利拉鲁肽促进 C3H10T1/2 骨髓间充质干细胞向成熟棕色脂肪细胞分化过程中棕色脂肪细胞特异性基因及线粒体功能相关基因的表达（以 qPCR 检测）A.细胞分化 2,4,6,8 天棕色脂肪细胞特异性基因的表达，B.细胞分化 2,4,6,8 天 mtDNA 的表达
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