GLP-1受体激动剂Exendin-4调控骨髓巨噬细胞极化改善骨质疏松及其机制研究

发布时间：2020-10-27 05:44

　　 目的动态的骨重建过程维持了骨骼的大小、体积、形态和力学的完整性。在骨重建过程中,成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收动态平衡,对于保持骨量和维持机体骨内环境稳态至关重要。年龄、激素水平、失重、细胞因子、血管、骨的微环境等多种因素均与骨重建密切相关。其中,骨的微环境变化在骨重建中的作用日益受到重视。业已证实,骨组织局部细胞因子、巨噬细胞分泌的IL-1、IL-4、TGF-β等细胞因子,在骨重建中发挥重要作用。探讨骨微环境变化对骨重建的影响和调控机理成为骨质疏松研究领域的新热点,对于发现潜在的治疗骨质疏松药物靶标十分重要。巨噬细胞是自身免疫系统中的重要组成部分,在宿主防御和炎性反应中发挥重要作用。近年的研究发现,骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage,BMDM)参与调控骨的重构过程,采用人工方式诱导BMDM凋亡,或者清除骨髓内BMDM,可导致受损骨修复过程中骨钙的沉积和矿化受到抑制,并抑制新骨的形成。然而,BMDM通过何种机理参与骨的重构目前尚属未知。我们前期的研究发现,胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂Exendin-4能够提高成骨细胞的活性,促进骨形成,抑制破骨细胞骨吸收。文献报道,巨噬细胞表达GLP-1受体,并且M2型巨噬细胞可以分泌很多促进骨形成的因子,例如TGF-β、骨桥蛋白(osteopontin)、1,25-二羟基-维生素D3和BMP-2等。当与骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSC)共培养时,巨噬细胞分泌的因子能够提高碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性和I型胶原(collagen I)的合成与分泌,从而促进BMSC向成骨细胞分化,从而促进骨形成。然而,M1巨噬细胞能够分泌大量的促炎因子,例如TNF-α、IL-1、IL-6等,这些细胞因子抑制成骨细胞的分化,促进破骨细胞前体的生成,导致骨形成降低,骨吸收能力增强,降低骨量。根据以上巨噬细胞对骨代谢的影响作用,我们提出假说:GLP-1受体激动剂Exendin-4是否可以通过与BMDM上GLP-1受体结合,调控炎性因子的分泌,进而促进骨形成,改善骨质疏松。为了证明此假说,本课题拟在整体动物水平、细胞水平和分子水平上研究Exendin-4对骨髓巨噬细胞的调控作用,以及对骨形成的影响。方法1.小鼠骨形态计量学指标和骨形成相关蛋白表达的检测选取3月龄C57BL/6雌鼠为实验对象,随机分为对照组、卵巢切除(OVX)组、OVX+Exendin-4组共三组,每组8只小鼠。腹腔注射Exendin-4(5μg/kg/d),每周给药6天,停1天,给药12周。治疗结束以前,先行小鼠进行活体Micro-CT扫描,用于骨组织形态学分析,观察骨小梁的结构变化。然后,取小鼠双侧股骨和胫骨,将样品随机分为3组,第一组骨组织样品脱钙处理后,骨组织切片、HE染色和TRAP染色,并采用免疫组化法检测骨组织中CD29、Sca-1、TGF-β1、CD68等的表达;第二组骨组织样品不脱钙,硬组织切片进行钙黄绿素和四环素双荧光标记,分析新骨形成情况;最后一组骨组织样品冷冻于液氮中,用于分析骨形成蛋白Osterix和Runx-2的表达以及TGF-β1蛋白的表达。为了观察BMDM对骨形成的影响,我们用氯膦酸脂质体清除小鼠体内巨噬细胞后进行骨形态计量学指标检测。选取3月龄C57BL/6雌鼠为实验对象,随机分组为对照组、卵巢切除(OVX)组、OVX+Exendin-4组、OVX+氯膦酸脂质体组、OVX+氯膦酸脂质体+Exendin-4组,共五组,每组8只小鼠。腹腔注射氯膦酸脂质体(混匀状态下,氯膦酸盐7 mg/ml,腹腔注射剂量为10μl/g),每3天给1次药,给药12周。治疗结束以前,对小鼠进行活体Micro-CT扫描,骨组织形态学分析,观察骨小梁的结构变化。治疗结束后,取小鼠双侧股骨和胫骨。将骨组织样品脱钙处理后,采用免疫组化检测骨组织中CD68、TGF-β1的表达。2.骨髓巨噬细胞的培养鉴定及诱导分化(1)BMDM的分离、培养及鉴定选取6-8周C57BL/6雌鼠为实验对象,脱颈处死后取双侧股骨及胫骨,剪去两端骨骺,用H-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,制成细胞悬液。离心,弃上清,加入培养液反复吹打至细胞悬液,接种于培养皿中。培养6 h后,吸取未贴壁细胞,离心,弃上清,加入含有10%FBS,终浓度为25 ng/ml的MCSF的H-DMEM培养液反复吹打至均匀地细胞悬液,接种于24孔板中,每3 d换一次液,培养7 d,采用流式细胞仪,通过检测细胞表面特异性抗原F4/80,CD11b进行鉴定。(2)BMDM的诱导极化及鉴定分离培养的BMDM经鉴定后,分别进行M1极化和M2极化培养。24孔板中加入诱导极化培养基。M1诱导极化组加入含有10%FBS,LPS(100 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)的H-DMEM培养液,培养3 d。M2诱导极化组加入含有10%FBS和IL-4(25 ng/ml)的H-DMEM培养液,培养3 d。采用ELISA方法检测极化后的BMDM培养液中TNF-α和IL-1ra的含量;采用RT-PCR和Western blot检测BMDM中的iNOS,Arg-1等基因和蛋白的表达。3.Exendin-4对BMDM极化的影响分离培养的BMDM经鉴定后,随机分为4组,分别为对照组、Exendin-4组、M1组和M2组。Exendin-4组加入含有10%FBS和Exendin-4(0.1 mmol/l)的H-DMEM培养液,培养3 d,M1和M2组培养方法同上。采用ELISA方法检测极化后的BMDM培养液中TNF-α和IL-1ra的含量;采用RT-PCR和Western blot检测BMDM中的iNOS,Arg-1等基因和蛋白的表达。4.Exendin-4作用于BMDM影响BMSC的迁移通过Transwell实验观察Exendin-4是否通过作用于BMDM影响BMSC的迁移。BMDM为下室细胞,BMSC为上室细胞。BMDM接种在24孔板中,100μl,10~6/ml。给予不同处理,分为对照组、MФ、LPS+IFN-γ、LPS+IFN-γ+MФ、IL-4、IL-4+MФ、Exendin-4、Exendin-4+MФ、IL-10(10 ng/ml)、IL-10+MФ、IL-10+MФ+TGF-β1 Ab(0.5μg/ml)、Exendin-4+MФ+TGF-β1 Ab、TGF-β1(1 ng/ml)、TGF-β1+TGF-β1 Ab组。上室中加入BMSC的细胞悬液150μl,2×10~5/ml。37℃,5%CO_2培养箱中培养24 h。4%多聚甲醛中固定30 min,PBS清洗3次,0.01%的结晶紫溶液中染色15 min,清洗,显微镜观察,计数。5.Exendin-4对骨组织血管形成的影响(1)整体动物水平检测Exendin-4对骨组织血管形成的影响选取3月龄C57BL/6雌鼠,随机分为对照组、卵巢切除(OVX)组、OVX+Exendin-4组共三组,每组8只。腹腔注射Exendin-4(5μg/kg/d),治疗结束后,取小鼠双侧股骨和胫骨。骨组织随机分为两组。第一组骨组织样品脱钙处理后,采用免疫组化检测骨组织CD31的表达。第二组骨组织样品液氮保存,RT-PCR和Western blot检测血管形成相关蛋白VEGF、MMP-2和CD31基因和蛋白的表达情况。(2)细胞水平检测Exendin-4对BMDM分泌促血管形成因子的影响BMDM随机分为4组,分别为对照组、Exendin-4组、M1诱导组和M2诱导组。Exendin-4组加入含有10%FBS和Exendin-4(0.1 mmol/l)的H-DMEM培养液,培养3d,M1诱导组和M2诱导组培养方法同上。采用RT-PCR和Western blot检测细胞中血管形成相关蛋白VEGF和MMP-2的基因和蛋白的表达情况。6.Exendin-4调控BMDM极化相关信号分子的检测BMDM培养液中加入Exendin-4,然后分别给予PKA抑制剂H-89、mTOR抑制剂Rapamycin和PI3K抑制剂wortmannin,Western blot检测M2型巨噬细胞标志蛋白Arg-1的表达,观察Exendin-4通过哪条信号通路影响巨噬细胞极化。用Exendin-4处理细胞,Western blot检测P-PKA,P-STAT3和TGF-β1的表达情况;Exendin-4处理BMDM的同时,分别给予腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、PKA抑制剂H-89和GLP-1R拮抗剂处理,Western blot检测细胞内P-STAT3的表达水平,确证Exendin-4调控巨噬细胞极化的信号通路。免疫共沉淀法检测GLP-1受体信号通路与BMDM极化通路之间互调的作用方式。结果1.BMDM参与Exendin-4改善OVX小鼠骨质疏松的作用OVX小鼠经Exendin-4治疗12周后,其股骨和胫骨的骨小梁数目和骨小梁厚度显著增加,骨微结构改善。HE染色结果显示,骨表面成骨细胞的数量显著增加,与成骨细胞活性相关的Runx-2和Osterix的表达也显著增加。TRAP染色结果显示,Exendin-4能够抑制破骨细胞的活性。免疫组化检测结果显示,Exendin-4能显著增加BMSC在骨表面的数量,提高TGF-β1在骨表面的表达,并且Exendin-4也能增加骨组织内TGF-β1蛋白的表达。免疫组化检测结果显示,OVX小鼠BMDM数量与对照组相比显著增多,给予氯膦酸脂质体处理后,小鼠骨髓内巨噬细胞(BMDM)的数量显著减少。清除小鼠BMDM后,Exendin-4促进骨小梁数量增多的作用显著减弱,同时,骨组织内TGF-β1的含量也明显降低。上述结果提示,BMDM参与了Exendin-4介导的骨形成作用。2.Exendin-4促进BMDM M2型极化,促进其分泌TGF-β1,继而诱导BMSC迁移检测确证分离获得的BMDM表达有GLP-1受体,Exendin-4处理BMDM后,其M2型细胞标志物Arg-1、CD206的表达显著增加,M1型细胞标志物iNOS、TNF-α显著减少。整体动物检测结果显示,Exendin-4能显著增加小鼠骨组织中巨噬细胞M2标志物Arg-1的表达,减少M1标志物iNOS的表达,增加小鼠血清中M2型巨噬细胞相关标志物IL-1ra的含量,降低M1型巨噬细胞相关标志物TNF-α的含量。以上结果提示,Exendin-4能够促进BMDM极化为M2型。进一步通过Transwell细胞迁移实验发现,Exendin-4处理巨噬细胞后,能够引发大量的BMSC迁移,Exendin-4促进BMDM表达和释放TGF-β1,预先给予TGF-β1抗体处理BMDM后,Exendin-4诱导BMSC迁移的作用显著减弱。上述结果提示,Exendin-4通过促进BMDM分泌TGF-β1,继而促进骨髓间充质干细胞的转移。3.Exendin-4激活BMDM中PKA-STAT3信号通路调控BMDM极化在培养的BMDM实验中发现,预先给与PKA抑制剂H-89后,Exendin-4促进Arg-1、P-STAT3和TGF-β1表达的作用显著减弱。进一步实验研究发现,GLP-1受体拮抗剂Ex(9-39)显著降低P-STAT3的表达,腺苷酸环化酶激活剂(Forsklin)能够显著提高P-STAT3的表达。免疫共沉淀结果显示,Exendin-4促进PKA蛋白和STAT3蛋白之间的相互作用。上述结果提示,Exendin-4通过激活cAMP/PKA/STAT3信号通路,进而促进STAT3磷酸化,继而促进BMDM向M2型极化,同时促进TGF-β1的生成和分泌,促进BMSC的迁移。4.Exendin-4促进BMDM分泌VEGF、MMP-2,促进血管形成。OVX小鼠经Exendin-4治疗12周后,其骨组织内VEGF、MMP-2和CD31的表达显著提高。免疫组化检测结果显示,Exendin-4能显著增加CD31阳性血管内皮细胞在骨组织内的数量。细胞检测结果显示,Exendin-4能显著提高BMDM产生VEGF和MMP-2。以上结果提示,Exendin-4可以通过促进BMDM分泌血管形成因子,继而促进骨内CD31阳性内皮细胞的增殖,促进血管生成,进而促进骨形成。结论1.Exendin-4可以改善OVX小鼠骨质疏松,该效应与BMDM密切相关。2.Exendin-4可以诱导BMDM向M2型极化,促进M2型巨噬细胞分泌TGF-β1,并促进BMSC向骨吸收表面转移,提高骨表面成骨的细胞数量,促进骨的形成。3.Exendin-4通过激动BMDM表面的GLP-1受体,继而激活cAMP/PKA/STAT3信号通路,促进STAT3入核,诱导BMDM发生M2极化。4.Exendin-4诱导的M2型BMDM能够分泌VEGF和MMP-2,VEGF和MMP-2则可能通过促进骨组织内血管形成,增加血流供应,最终促进新骨形成。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【文章目录】：
缩略语表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文献回顾
    一.骨质疏松与骨重建
    二.GLP-1受体激动剂与骨代谢
    三.骨髓巨噬细胞与骨代谢
第一部分 EXENDIN-4改善卵巢切除小鼠骨质疏松作用依赖于骨髓巨噬细胞的存在
    1 材料
    2 方法
    3 结果
    4 讨论
第二部分 EXENDIN-4调控骨髓巨噬细胞向M2型极化
    1 材料
    2 方法
    3 结果
    4 讨论
第三部分 EXENDIN-4激活BMDM中PKA-STAT3信号通路促进骨形成
    1 材料
    2 方法
    3 结果
    4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢

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本文编号：2858128