人脐带间充质干细胞制备及治疗系统性红斑狼疮的临床研究

发布时间：2020-10-29 06:26

　　 [目的]1.建立制备人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的方法,分离、扩增、鉴定hUCMSC,为临床提供材料。2.建立hUCMSC治疗系统性红斑狼疮(SLE)的临床技术方案,实施10例SLE患者hUCMSC的临床治疗,为hUCMSC治疗SLE提供示范性技术方法和理论基础。[方法]1.hUCMSC的制备取足月健康新生儿脐带,将其分解为1mm3组织块并采用反复3次贴壁法分离、扩增hUCMSC,倒置相差显微镜观察细胞生长特性,流式细胞术检测hUCMSC细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34和CD45的阳性表达率,hUCMSC成脂、成骨和成软骨定向诱导分化分析其分化潜能。2.hUCMSC治疗经省卫计委立项批准,选择解放军昆明总医院肾脏风湿免疫科满足纳入标准的20例SLE患者作为受试者参与实验,签订知情同意书,随机分为治疗组和对照组,每组各10名。对照组于d1采血作为治疗前样本并静脉输注甲泼尼龙15 mg/(kg· d),d4改为口服泼尼松片1 mg/(kg· d),2周后间隔2周减量10%,同时每4周1次静脉输注环磷酰胺(CTX)1 g/次,共5次;治疗组在d6时开始静脉输注hUCMSC 1×106个/Kg,1次/周,连续3次。3.hUCMSC的疗效评价于hUCMSC治疗结束后第2周、4周、8周、12周、24周时观察、分析患者的临床症状、狼疮活动度及血尿常规、生化指标和免疫学指标;采用蛋白芯片对hUCMSC治疗前后血清蛋白因子进行分析,并对有显著差异的特征性细胞因子进一步行ELISA检测验证。统计分析组间、组内指标差异。[结果]1.hUCMSC的制备组织块直接贴壁法培养hUCMSC 7天后可见细胞从组织块爬出,三次组织贴壁培养细胞呈成纤维样且具有典型的涡旋式生长特征;第三代hUCMSC的CD73、CD90和C0105的表达率为98.7%、82.6%和80.1%,CD34和CD45表达率分别为0.17%和0.92%;成脂诱导分化2周后,油红O染色阳性,成骨诱导分化3周后,茜素红染色阳性;成软骨诱导4周后,阿新蓝染色阳性。2.hUCMSC 疗效(1)临床症状、体征及SLEDAI评分:全部病例在治疗2周后两组患者发热消失、皮疹消退,治疗4周后治疗组和对照组疲倦、乏力等症状减轻率分别为80.0%(8例)和70.0%(7例),关节痛明显减轻率分别为60.0%(6例)和70.0%(7例),完全或者部分缓解率分别为80%(8例)和70%(7例),组间无明显差异(P0.05)。治疗组的SLEDAI评分显著低于治疗前(P0.05)。(2)实验室指标变化:①组间比较:治疗组血清补体C3含量显著高于对照组(P0.05),组间 WBC、RBC、PLT、Hb、U-PRO、BUN、Cr、TP、ALB、IgG、IgA、IgM、C4无显著差异(P0.05)。②组内比较:外周血RBC、Hb、TP、ALB含量均升高、Cr含量下降(P0.05),U-PRO、GFR、IgA、IgM无差异(P0.05);治疗组IgG在治疗后升高(P0.05)。③起效时间比较:治疗组外周血ALB、Hb含量分别于治疗2周、4周明显升高,Cr于2周后下降(P0.05),对照组ALB、Hb分别于治疗后4周、8周明显升高,Cr于8周后下降(P0.05);两组外周血TP和RBC含量均于治疗后12周和24周明显升高(P0.01和P0.05)。④免疫学指标:外周血CD3+CD4+阳性率治疗后下降,NK阳性率治疗后升高,与治疗前相比分别从第4周、24周差异明显(P0.05);抗ANA抗体和抗dsDNA抗体滴度治疗后显著下降(P0.05)。(3)治疗组血清细胞因子分析:蛋白芯片分析显示:ICAM-1(CD54)、TNF-RII、TIMP-2、TIMP-1、IGFBP-3、IGFBP-6、SCF-R(CD117)、BMP-5 均呈高表达状态;BLC(CXCL13)、IL-4、BMP-4、EGF、BDNF、β-NGF在治疗后下降,而IL-12p70、AR升高。进一步定量检测BLC(CXCL13)、BDNF、BMP-4,结果与蛋白芯片一致,BLC(CXCL13)降低明显(P0.05),BDNF和BMP-4均降低,但无显著差异(P0.05)。[结论]1.采用多次组织块反复直接贴壁培养法获得形态、生长特性、细胞表面表达标志物和诱导分化功能符合hUCMSC标准。2.hUCMSC治疗可显著改善SLE患者的临床症状及体征,降低SLEDAI评分和自身抗体滴度,使外周血中RBC、Hb、TP、ALB、IgG、补体C3、CD3+CD4+阳性率明显升高,NK阳性率明显降低,缩短IgG和补体C3、ALB和Hb含量上升时间。3.hUCMSC 治疗使血清中 BLC(CXCL13)、IL-4、BDNF、BMP-4、EGF、β-NGF含量下降,IL-12p70、AR上升,表明hUCMSC治疗可能通过调节细胞因子表达水平来抑制SLE患者的自身免疫反应。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R593.241
【部分图文】：

图２治疗前有差异指标比较图??２．２．２技术路线??临床症状、体征观察??＾治疗组１０例???丨?ｒ，ｒ巾卞｜?随机?／血样【ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、ＣＲＰ、Ｃ３、??｜?ＳＬＥ患者筛选??＾ｐ｜ｃ４、丨ｇＧ?ＡＬＢ、ＴＰ等检测??——对照组１０例｜???Ｉ?，??｜?—８０°Ｃ?冻存?｜??Ｘ?＇?ｉ??细胞因子蛋?｜?ＢＤＮＦ、ＢＬＣ、??白芯片夯析?ＢＭＰ－４定量检测??｜??Ｉ??统计分析??．．

（１）?ｈＵＣＭＳＣ的形态特点：根据ｈＵＣＭＳＣ贴壁生长的特性，通过组织块??直接贴壁培养法培养人脐带间充质千细胞，将１ｍｍ３左右大小的脐带组织均匀种??植在培养瓶中，可观察到５天后即有少量细胞爬出，呈短梭形（如图３Ａ），?８天??后贴壁生长的细胞逐渐增多，围绕组织周围并呈集落状；１２天后可见大量细胞??呈旋涡状生长，细胞融合度为８０％时可进行第一次换液传代（如图３Ｂ）。??ｈＵＣＭＳＣ传代至第３到第５代时细胞均匀散落瓶底贴壁生长，形态均一，均呈??长梭形、成纤维细胞样、涡旋状生长特性（如图３?Ｃ，Ｄ）。??ｍｍ??注：Ａ、原代培养５天后爬出的ｈＵＣＭＳＣ形态；Ｂ、原代培养１２天后的ｈＵＣＭＳＣ；?Ｃ、第３??代?ｈＵＣＭＳＣ；?Ｄ、第?５?代?ｈＵＣＭＳＣ??图３?ｈＵＣＭＳＣ光学镜下的生长形态（Ａ、Ｂｘ４０；?Ｃ、ＤｘｌＯＯ）??（２）?ｈＵＣＭＳＣ细胞表型：第３代ｈＵＣＭＳＣ流式分析结果显示（如图４）：??匚０７３、００９０和００１０５的阳性表达率分别为为９８．７０％、８２．６０％和８０．１０％，??００３４和＃埃矗档难粜员泶锫史直鹞?埃?保罚ズ停埃?梗玻ァ＃崳?２９??

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【参考文献】

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本文编号：2860520