PTC124对PAH无义突变蛋白体外表达的矫正作用

发布时间：2020-10-29 07:26

　　 苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一类由于体内苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)代谢异常而导致的疾病,呈常染色体隐性遗传。PKU在世界范围内分布广泛、发病率高,会严重影响患者的认知和心理。目前PKU患者主要通过饮食疗法控制病情,这种方式不仅降低了患者的生活质量,也给社会带来极大的经济负担。因此,临床上需要新的治疗方法。部分PKU患者的病因来自苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanine hydroxylase,PAH)的无义突变,这种突变类型在某些实验中可以被新型化合物PTC124矫正。本实验通过构建相关载体,对转染无义突变PAH基因的细胞进行PTC124处理并检测其在转录和翻译水平上的变化,探索了PTC124对PAH无义突变类型_(Y356X)PAH和_(W326X)PAH在表达过程中的矫正效果,以期为PKU的治疗提供新策略。1、构建相关载体本实验利用基因工程技术,成功构建6个真核表达载体。一类是带有红荧光标记的pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-_(Y356X)PAH和pCMV-DsRed-_(W326X)PAH,另一类是带有G418标记的pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH。2、体外表达系统的确定通过查阅文献选择HEK293细胞实现载体基因的表达。购买细胞株后通过常规的细胞培养技术对细胞进行扩培,并对其mRNA进行初步分析,未检测出PAH基因的表达,证明HEK293细胞符合实验要求。3、载体的转染及细胞筛选本实验采用脂质体转染的方式将载体基因分别导入HEK293细胞。对转染了pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-_(Y356X)PAH和pCMV-DsRed-_(W326X)PAH的细胞进行流式细胞仪检测,转染效率达到72%。对转染了pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH的细胞进行G418筛选,存活细胞即为阳性细胞。4、PTC124浓度的确定分别用浓度为0μM、50μM、100μM和200μM的PTC124处理HEK293细胞,再对其进行细胞活力、细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖分析。发现浓度为50μM和100μM的PTC124对细胞是相对安全的,浓度为200μM的PTC124对细胞活性和细胞增殖都有消极影响,还会将细胞阻滞在S期,同时促进细胞凋亡。最后选择100μM为后续实验中PTC124的处理浓度。5、各实验组的检测使用载体pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-_(Y356X)PAH、pCMV-DsRed-_(W326X)PAH、pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH分别对HEK293细胞进行脂质体转染,然后将其分成两部分:对照组是转染PAH基因的细胞,进行正常的细胞培养;实验组是转染了无义突变PAH基因的细胞,一部分进行普通培养,另一部分用浓度为100μM的PTC124处理。48h后分别对上述细胞进行qPCR和Western Blot检测。qPCR实验表明,各实验组均表达了PAH。PAH无义突变基因的表达量经矫正培养后明显高于普通培养,但仍低于转染PAH基因的表达量。Western Blot实验表明,各实验组都成功表达了PAH蛋白。经矫正培养后无义突变实验组产生的PAH增多。利用酶活性实验检测野生型和无义突变PAH的活性。分别利用pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH载体转染细胞,转染了PAH基因的细胞正常培养,作为阳性参照。转染了PAH无义突变基因的细胞分别经过普通培养和矫正培养。实验发现,转染野生型PAH基因的细胞合成了有活性的PAH;转染了pcDNA3.1-_(Y356X)PAH和pcDNA3.1-_(W326X)PAH的细胞中,经过普通培养的未检测到活性PAH,经过PTC124矫正后细胞合成了有活性的PAH;与转染野生型PAH基因的细胞相比,转染载体pcDNA3.1-_(Y356X)PAH的活性达到了19%,转染载体pcDNA3.1-_(W326X)PAH的活性达到了13%。综上所述,PTC124在PAH突变基因_(Y356X)PAH和_(W326)XPAH的表达过程中可以发挥矫正作用,使之能够合成有活性的PAH蛋白。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R596.1
【部分图文】：

因中存在大量已知突变，因此可以通过使用先进的分子遗传这种诊断的确认[39]。世界上分布最广泛的遗传类代谢疾病。这种病的患者由于代丙氨酸（Phe）大量代谢为酪氨酸，因此产生了一系列临床症丙氨酸（Phe）在体内的代谢途径主要有三种（如图 1.1）：这是体内的主要代谢途径；一种是经过脱氨基作用转化为苯丙谢途径；另一种是转化为羟苯丙氨酸，代谢产生尿黑酸，再0]。PKU 患者由于体内合成 PAH 的数量降低或活性不足，不能累了大量 PAH，此时代谢旁路增强，Phe 被催化成苯丙酮酸。酮酸和血苯丙氨酸会抑制髓磷脂的合成，造成大脑白质异常

图 1.2 理论上可用于身体不同部位的治疗方案[93]。g. 1.2 Therapeutic regimen can be used theoretically on different parts of the bo可能应用于身体各部位的治疗方法。BBB 适用于 LNAA 疗法，NAA 跨越 BBB 的竞争抑制。肝脏适用于基因治疗，定点整合野生在肝脏中引入野生型 PAH 基因；BH4疗法，增加一些患者的 PA助错误折叠的 PAH 折叠成有活性的 PAH。大脑适用于所有的治疗疗法，采用静脉注射 PAL。消化道适用于酶替代疗法，口服活性少进入循环系统的 Phe。肌肉适用于基因治疗，结合野生型 PAH 5 个完整基因，改变基因治疗靶点。s 的治疗方法也是一种对 PKU 十分有效的治疗方法。LNAA 可以白结合实现跨越过程。而在体内环境中，LAT1 转运蛋白对 LN

PTC124 对 PAH 无义突变蛋白体外表达的矫正作用 多磊（Easobio）；一抗 PAH（Abcam）；二抗 Goat pAb to Rbbit泳缓冲液 10×（康为世纪）；G418（全式金）。建因 PAH、Y356XPAH 和W326XPAH 的表达载体的构建库中检索人的 PAH 基因序列，找到其 CDs 区域的碱基序列
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本文编号：2860578