胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP6）在CIA大鼠中的表达和意义

发布时间：2020-11-08 14:52

　　 目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病。其还可伴随并发复杂的关节外表现,目前研究还发现RA会使许多疾病的发生率增加。RA的发病机制尚不清楚,目前主要认为受免疫、遗传、环境等多方面因素共同影响。近年来发现,六种高亲和力胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)家族是IGF作用的主要调节剂。并已被证实是众多生物学过程如细胞周期、增殖、代谢中的调节因子之一。IGFBPs的异常表达涉及许多疾病的病理过程,如肿瘤、心血管系统疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病等。胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP6)属于IGFBPs,具有依赖或非依赖IGF而发挥抑制细胞增殖和血管的生成,以及诱导肿瘤中的细胞凋亡和细胞迁移的作用。其可分别在胞内和核内发挥作用,且其差异性表达被发现在多种疾病中。由于IGFBP6在大鼠和人之间高度同源。且已经证实,胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型是鉴定RA易感性和相关慢性炎症性自身免疫疾病的有用模型。CIA大鼠模型的使用可以减少研究对象之间的差异,并使人们更清楚地了解RA的复杂病理机制。因此,选择CIA大鼠模型来研究IGFBP6在RA中的表达差异及其相关性。目前,虽然甲氨蝶呤(MTX)广泛用于RA的治疗,但MTX治疗受到副作用的严重影响,限制了其应用。因此,本研究还考虑了在MTX作用下IGFBP6的变化,寻找MTX对RA作用的潜在反应生物标志物,为RA的治疗寻找新的靶点。研究方法:24只Wistar大鼠分为正常组,CIA组和CIA+MTX组。正常组进行对照,CIA组用Ⅱ型胶原二次免疫的方法造CIA大鼠模型,CIA+MTX组在造模的基础上用甲氨蝶呤(1.5mg/kg)治疗。采用酶联免疫吸附试验以及蛋白质印迹和逆转录聚合酶链反应的方法在蛋白质和mRNA水平上检测三组大鼠血清、滑膜、脾脏中IGFBP6的表达差异,并分析IGFBP6表达与关节炎指数之间的相关性。结果:1、血清中IGFBP6水平,与正常组相比,CIA组大鼠血清中IGFBP6水平显着增加。给药后,血清IGFBP6水平显着降低,但与正常组相比仍存在一些差异。在CIA组,IGFBP6血清浓度与CIA大鼠的关节炎指数评分正相关,但在正常组和CIA+MTX组中并没有相关。2、滑膜和脾脏样品中IGFBP6水平,与对照组相比,来自CIA组大鼠的滑膜和脾样品中IGFBP6表达显着增加。相比之下,MTX给药可以降低CIA大鼠模型滑膜和脾脏中IGFBP6的增加,但与对照组相比仍有一些显着差异。3、滑膜和脾脏样品中的IGFBP6 mRNA水平,CIA组中滑膜样品的IGFBP6 mRNA水平显着高于正常组,并且在MTX给药后显着降低。脾脏有类似的变化。且在CIA组中滑膜和脾中的IGFBP6 mRNA水平和大鼠的关节炎指数正相关,但是在正常组和CIA+MTX组没有观察到这一结果。结论:我们的数据突出显示与对照组相比,在CIA大鼠中IGFBP6在血清、滑膜、脾中IGFBP6的高表达,并证明其与疾病活性正相关。因此,IGFBP6可能可以作为RA严重程度的标志物。同时,IGFBP6的表达可以通过MTX的作用下调,且其与MTX有相同的作用通路。表明IGFBP6可能是MTX治疗RA的新的潜在治疗靶点。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

中国医科大学硕士学位论文3 结 果3.1 CIA 大鼠模型的构建3.1.1 CIA 大鼠模型示意图概述 CIA 大鼠造模和治疗的示意图。适应性喂养 14 天后，在第 0 天和第 7天对雌性 Wistar 大鼠进行免疫。第 14 天评估关节炎指数评分（评分≥2），将CIA 大鼠随机分组并用 MTX（1.5mg / kg）或 PBS 进行胃内给药。每周一次，共3 周。在实验的终点，处死大鼠并收集组织用于进一步分析。如图 1 所示。

21图 2. CIA 大鼠造模的评估来自不同实验组的大鼠的代表性图像（A）。 不同处理下大鼠体重变化（B）。 不同处理下大鼠的关节炎评分（C）。 在不同处理下大鼠的关节肿胀度（D）和足爪厚度（E）。 处死大鼠后，收获脾脏（F）。 数据表示为每组 8 只动物的平均值±SEM，并通过多重 ANOVA（脾指数的单因素 ANOVA）进行分析。数据代表八个实验，产生了类似的结果。* p <0.05;** p <0.01; *** p <0.001; **** p <0.0001

中国医科大学硕士学位论文7）如图 3A 所示，为了进一步评估 CIA 模型的构建，采用免疫染色的方法进行评估，分别在 100*和 200*的放大下观察。RA 的病理特征，包括炎性细胞浸润，滑膜增生，软骨破坏和骨侵蚀等。在正常组中，我们可以看到无炎性细胞亲润及滑膜增生，关节面光滑，无破损。在 CIA 组中我们可以明显的看到关节面的破坏，毛刺状，关节面不连续，关节软骨和滑膜的破坏。在 CIA+MTX 组中我们可以观察到其关节面没有正常组光滑，但没有看到明显的关节面破坏。软骨细胞排列也相对整齐。我们进一步使用半定量分级量表进行组织病理学评估。如图 3B 所示，在 CIA 组中，增加的细胞浸润和软骨变性转化为组织学评分为 5.13±0.35。CIA+MTX 组中组织学评分较低，为 2.25±0.45。经统计学分析，这种差异具有统计学意义（p <0.05）。
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本文编号：2874933