2017年国际糖尿病联盟(IDF)最新统计数据显示,目前全球有4.25亿人罹患糖尿病,糖尿病已成为21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,严重影响人类的生命健康。而糖尿病周围神经病变作为最常见的糖尿病慢性并发症之一,可以引起反复下肢感染、溃疡、非创伤性截肢等,花费巨大,致残率高,严重降低患者的生活质量。经典的Wnt信号通路在代谢性疾病的发生中也发挥着广泛的作用。参与调控脂肪细胞分化,胰腺器官发育,胰岛β细胞分化,胰岛素的合成和分泌等,对糖尿病的发生、发展及并发症的出现起着重要的作用。近年来研究表明,经典的Wnt信号通路与神经系统密切相关,在神经管的形成、背根神经节及中脑的发育中有重要作用。但经典的Wnt信号通路与糖尿病周围神经病变的关系并不清楚,因此深入研究经典Wnt信号通路与DPN发生的关系并揭示作用机制,对于防治糖尿病周围神经病变具有重要的临床意义。第一部分确定经典Wnt信号通路关键基因在DPN患者中表达情况的变化目的以正常人群、无DPN的糖尿病患者及并发DPN的糖尿病患者空腹外周血液作为研究对象,探究经典Wnt通路关键分子在这三组人群中表达的差异,并分析其表达水平与糖尿病临床指标之间的相关性。方法1.自2017年12月-2018年5月,按照糖尿病临床诊断标准和DPN诊断标准,收集正常人群、无DPN的糖尿病患者及并发DPN的糖尿病患者的空腹外周血液,外周血EDTAK2抗凝处理后置于-80℃冰箱保存备用。同时收集三组人群的临床生化检测数据及T2DM患者的病历资料。2.提取血液总RNA并测定其纯度和含量,反转录反应得到RNA的c DNA。3.利用Real-Time PCR技术及经典Wnt通路关键分子β-catenin,c-myc,cyclin D1,DKK1的正向和反向引物进行扩增,扩增内参基因β-actin作为对照,分析经典Wnt通路关键分子在三组人群中的表达差异。4.分析经典Wnt通路关键分子表达水平与Hb A1c之间的相关性。结果1.经典Wnt通路关键分子在三组人群中的表达差异:Real-Time PCR结果显示,β-catenin,c-myc,cyclin D1在T2DM及DPN患者中表达降低(P0.05),而DKK1在T2DM及DPN患者中表达升高(P0.05),且在DPN患者中更甚。2.β-catenin,c-myc,cyclin D1分子水平与T2DM人群的Hb A1c呈负相关,DKK1分子水平与T2DM人群的Hb A1c水平呈正相关。结论经典Wnt通路下游基因β-catenin,c-myc,cyclin D1的表达水平在T2DM及DPN患者中降低,而其负性调控分子DKK1在DPN患者中异常高表达,且与Hb A1c水平有显著相关性,提示经典的Wnt信号通路功能降低可能促进DPN的发生。第二部分探究体内抑制经典的Wnt信号通路对DPN发生的影响目的通过构建T2DM小鼠模型,小鼠灌胃给药Wnt通路抑制剂C59,观察抑制经典的Wnt信号通路后对DPN发生发展的影响。方法1.T2DM小鼠模型的建立:4周龄C57B6小鼠,体重13-15 g,适应性喂养1周,随机数字表法选取6只以标准小鼠饲料(Normal chow diet)饮食作为基础对照组,即为Chow-NC组;其余小鼠,60%脂肪含量的高脂饮食喂养四周后,禁食14小时,按照40 mg/(kg·d)注射链脲佐菌素(STZ)溶液,连续注射5天。注射STZ后饮用10%蔗糖水3天,10天后尾尖采血测血糖,3次随机血糖16.9 mmol/L视为造模成功。2.小鼠分组:将T2DM小鼠按照随机数字表分为2组,1组灌胃给药生理盐水,作为对照,即为T2DM-NC组;1组灌胃给药Wnt通路抑制剂C59 10 mg/(kg·d)每2天注射一次,即为T2DM-C59组,高脂喂养持续至实验终点。3.观察小鼠毛色、精神状态、日常活动、饮水及饮食情况等。记录四组小鼠第4、8、14、17、19、21周体重,禁食12小时后,尾静脉剪尾取血检测小鼠空腹血糖。4.小鼠后肢痛觉检测:固定检测小鼠右后肢足底,刺激强度为35%,刺激次数3次,每次间隔30分钟,记录小鼠缩爪时间。每四周检测一次,直至实验终点。5.运动能力的检测:以17 m/min,30分钟时长,记录小鼠被电击次数,每四周检测一次,直至实验终点。6.实验动物取材:至实验终点时,小鼠禁食12小时,7%水合氯醛麻醉后,小鼠眼球取血,使用一次性负压采血管EDTAK2抗凝,以4℃,5000 r/min,离心20分钟,获得上清液,分装于Ep管中,-80℃冰箱冻存待用。小鼠仰卧位固定于操作台上,皮肤消毒后,于股骨干前外侧剪开小鼠皮肤,充分暴露,取小鼠腿部肌肉,置于冻存管液氮速冻,用于分子生物学检测。7.检测血清中血清胰岛素含量、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、总胆汁酸浓度。结果1.造模小鼠出现胰岛素抵抗、高血糖、血脂紊乱等T2DM主要临床特征。因腹腔注射STZ会导致胰岛细胞受到损伤,因此高脂组体重略低于正常对照组,且高脂组小鼠体重增长缓慢,血糖升高,符合糖尿病表现,表明T2DM小鼠模型造模成功。2.抑制内源性经典的Wnt信号通路后,小鼠空腹血清胰岛素水平、TG、C-THO、LDL较高(P0.05),小鼠血糖及血脂代谢紊乱更为严重,胰岛素抵抗更为显著。3.肝脏油红O染色结果显示:抑制经典的Wnt信号通路后,小鼠肝细胞空隙变大,肝索排列紊乱,肝细胞内可见的红色脂滴明显增多,表明肝脏内脂质沉积更为严重。4.通过对小鼠足底热刺痛以及运动能力的检测,发现经典的Wnt信号通路受到抑制后,小鼠对热痛刺激的反应时间延长,运动耐力明显下降。结论抑制内源性经典的Wnt信号通路,小鼠血糖及血脂代谢紊乱,胰岛素抵抗显著,周围神经的受损程度加剧,导致神经营养功能障碍,使运动耐力进一步下降。第三部分揭示抑制经典Wnt信号通路促进DPN发生的分子机制目的以两组小鼠骨骼肌作为研究对象,探究经典Wnt通路关键分子在两组小鼠中的表达差异,以及促进DPN发生发展的分子机制。方法1.使用Trizol法提取肌肉组织总RNA并测定其纯度和含量,反转录反应得到RNA的c DNA。2.利用Real-Time PCR技术及经典Wnt通路关键分子c-myc,cyclin D1,VDL1,FZD7的正向引物和反向引物进行扩增,同时扩增β-actin基因作为对照,分析经典Wnt通路关键分子在两组小鼠中的表达差异。Western blot进一步验证经典Wnt通路关键分子的蛋白表达情况。3.利用RNA转录组深度测序检测两组小鼠骨骼肌基因表达谱的变化。利用生物信息学方法预测影响DPN发生发展的靶基因及分子通路。4.利用双夹心ELISA法检测三组人群血清中IL-6、HIF-1α水平,利用三组人群的临床血液生化数据,分析IL-6、HIF-1α水平与Hb A1c之间的相关性。5.利用Real-Time PCR、Western blot等技术检测三组人群外周血、小鼠骨骼肌组织中线粒体拷贝数及ATP含量等指标的变化,验证抑制该通路促进DPN发生发展的分子机制。结果1.Real-Time PCR结果显示,抑制经典Wnt通路后其关键基因c-myc、cyclin D1的表达量下降(P0.05);Western Blot结果也进一步证实,抑制经典Wnt通路后磷酸化β-catenin与总β-catenin比值升高(P0.05)。说明作用Wnt-C59通过抑制经典Wnt通路中关键基因的表达干扰了经典Wnt通路的正常传导。2.根据深度测序结果及生物信息学分析,确定抑制经典Wnt通路促进DPN发生发展的具体信号通路。3.与对照组相比,IL-6、HIF-1α在T2DM及DPN患者中表达升高(P0.05),在DPN患者中降低更为显著,且血清中IL-6、HIF-1α水平与糖尿病人群的Hb A1c显著相关。4.抑制经典Wnt通路后,HIF-1代谢通路中的关键分子,IL-6的m RNA表达升高(P0.05);磷酸化STAT3与总STAT3比值升高(P0.05),同时HIF-1αm RNA的表达也明显升高(P0.05)。说明抑制经典Wnt通路会诱导IL-6炎症因子的过量表达并活化STAT3蛋白,促使HIF-1α表达增加;并进一步下调TFAM的表达及mt DNA拷贝数(P0.05),抑制线粒体的呼吸氧化功能及ATP的生成,加重周围神经的受损程度。结论抑制经典Wnt通路,能够激活IL-6/STAT3/HIF-1α信号代谢通路,诱导低氧诱导因子表达增加,进一步降低TFAM的表达水平及mt DNA的拷贝数,抑制线粒体呼吸氧化功能和ATP生成,促进DPN的发生发展。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：
图 1. 1 经典 Wnt 通路关键分子在三组人群外周血液中表达情况注：A. β-catenin 在三组人群中的表达情况；B. c-myc 在三组人群中的表达情况；C. cyclinD1在三组人群中的表达情况；D. DKK1 在三组人群中的表达情况；β-catenin：β-连环蛋白；cyclinD1：G1/S-特异性周期蛋白-D1；c-myc：myc 癌基因；DKK-1：Dickkopf-1，Wnt 通路特异性抑制剂；与 Normol 组比#，P < 0.05；与 T2DM 组比*，P < 0.054.2 经典 Wnt 通路关键基因表达水平与糖尿病人群 HbA1c 显著相关收集实验组的血液生化检验数据，整理出 HbA1c 检测值。分析后发现，经典 Wnt 通路关键分子 β-catenin,c-myc,cyclinD1 表达水平与糖尿病人群的 HbA1c呈显著负相关（P＜0.05），而 DKK1 表达水平与个体的 HbA1c 呈正相关（P＜0.05）。说明经典 Wnt 通路关键分子的表达水平与 T2DM 的发病程度呈显著相关性，或可作为用于临床诊断 T2DM 的新的分子标志物。为进一步揭示经典 Wnt通路关键分子与 T2DM 及 DPN 发生之间的关系，我们需要寻找 T2DM 发生过程中经典 Wnt 通路可能直接作用的靶基因或信号通路。
图 1. 2 经典 Wnt 通路关键分子表达水平与糖尿病人群 HbA1c 的相关性分析注：A. β-catenin 与糖尿病人群 HbA1c 的相关性；B. c-myc 与糖尿病人群 HbA1c 的相关性；C. cyclinD1 与糖尿病人群 HbA1c 的相关性；D. DKK1 与糖尿病人群 HbA1c 的相关性5 讨论糖尿病患者持续的高血糖激活多醇葡萄糖代谢通路，导致上皮细胞功能紊乱，细胞中毒性代谢物增多，引起以周围神经病变为基础的全身多部位神经损伤[10]。近年来研究表明，经典的 Wnt 信号通路，与神经系统密切相关，在神经管的形成、背根神经节及中脑的发育中有重要作用[8]，经典的 Wnt 信号通路激活后在髓鞘再生和轴突再生过程中具有促进作用[9]。Wnt 通路受多种拮抗剂或调节剂家族调控，包括分泌卷曲相关蛋白（secreted frizzled related protein,sFRP）和dickkopfs（dickkopfs, DKK）以及 Wnt 抑制因子-1（Wnt inhibitor-1, WIF1）[11-13]。Dickkopf-1（DKK-1）是 Wnt 信号通路的一种成熟的特异性抑制剂[14]，据报道，DKK-1 mRNA 在大多数正常人类组织，如心脏、肝脏、肺、肾脏、大脑和骨髓
第二部分 探究体内抑制经典 Wnt 信号通路对 DPN 发生的影响4.1 体内抑制经典 Wnt 通路后小鼠体重降低、肝重增加如图所示，4-21 周期间，与 Chow-NC 组小鼠相比，T2DM 组小鼠体重减低，且 T2DM-C59 组小鼠降低更为显著（P<0.05，图 2.1 A）；T2DM 组小鼠平均肝重较高，且 T2DM-C59 组小鼠更为显著（P<0.05，图 2.1 C）；至实验终点时，T2DM组小鼠肝重/体重比值较高（P<0.05，图 2.1 B），且 T2DM-C59 组小鼠更为显著。因腹腔注射 STZ 会导致胰岛细胞受到损伤，糖代谢紊乱，加重体内营养物质的异常分解，因此高脂组体重略低于正常对照组，且 T2DM-C59 组小鼠体重增长更为缓慢。4 结果
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