基于p-硝基苯丙氨酸插入法构建自体蛋白RANKL的新型疫苗用于抗骨质疏松治疗
发布时间：2020-11-19 07:45
骨质疏松症是主要表现为骨量减少、骨微结构破坏,导致骨骼强度和负荷承受能力降低,易于发生脆性骨折的一类全身性骨代谢障碍疾病,也是多种骨破坏性疾病共有的病理损害。骨质疏松发病率高,严重影响患者的生活质量,给社会带来沉重的经济负担。正常骨代谢主要依赖于破骨细胞发挥的骨吸收作用和成骨细胞发挥的成骨作用之间的平衡。任何原因导致这种平衡的破坏都会引起骨代谢性相关疾病。其中,破骨细胞活性和功能的增强在这一过程中发挥着极其重要的作用。核因子κB受体活化因子配体(RANKL,Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand)对破骨细胞的分化、成熟及功能都发挥着关键性作用。RANKL结合到破骨前体细胞的核因子κB活化因子受体(RANK)上,启动下游NF-κB,P38,ERK,JNK等信号通路,刺激破骨细胞的分化、成熟及功能。阻断RANKL与RANK的结合,可抑制破骨细胞的分化和成熟。抗RANKL单克隆抗体Denosumab可以特异性地阻断RANKL与其受体的结合,有效地的抑制破骨细胞的分化、成熟和功能,对骨质疏松等骨吸收性疾病疗效明显。最近研究表明,在自体蛋白中插入非天然氨基酸(p-硝基苯丙氨酸)可以突破免疫耐受,使机体产生针对自体蛋白高滴度的抗体。本研究依据小鼠RANKL的三维晶体结构信息,利用p-硝基苯丙氨酸插入这一全新的技术对RANKL进行多点定向插入修饰,探讨p-硝基苯丙氨酸突变的小鼠RANKL蛋白的克隆、原核表达和纯化,构建和筛选针对自体蛋白RANKL的高效疫苗,并探索其对OVX小鼠骨质疏松的治疗作用。【方法和结果】(1)首先通过RT-PCR克隆了具有活性的小鼠RANKL(mRANKL)的胞外段基因,将编码第164、234、240、272位氨基酸的密码子突变成能编码p-硝基苯丙氨酸(pNO_2Phe)的密码子,然后构建了pET28a-pNO_2Phe mRANKL重组表达载体并经测序验证构建成功。(2)成功将四个突变的pET28a-pNO_2Phe mRANKL重组表达载体与pEVOL质粒共转化至E.coli BL21(DE3)原核表达菌中,用阿拉伯糖和IPTG诱导,成功表达并纯化了目的蛋白(这四个突变的mRANKL蛋白分别简写为F~(164)pNO_2Phe、Y~(234)pNO_2Phe、Y~(240)pNO_2Phe和Y~(272)pNO_2Phe)。经SDS-PAGE与Western Blot检测,该蛋白与预测蛋白大小一致;通过高效液相色谱联合质谱检测进一步证实成功插入了p-硝基苯丙氨酸。(3)以纯化蛋白作为免疫原,采用多位点皮下重复注射的方法免疫小鼠,采用Western Blot和间接ELISA分别检测抗mRANKL抗体滴度和抗血清活性。结果表明,成功制备了小鼠抗mRANKL的抗血清,该抗血清具有较高的活性。Y~(234)pNO_2Phe和Y~(240)pNO_2Phe所产生的抗体滴度更高,且能维持168天。其抗血清在体外可抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。(4)通过建立小鼠OVX骨质疏松模型,探究了疫苗对小鼠骨质疏松的治疗效果。结果显示,筛选出来的两个疫苗(Y~(234)pNO_2Phe和Y~(240)pNO_2Phe)对OVX骨质疏松小鼠均具有一定的治疗效果。【结论】通过本实验,我们首次克隆并表达了p-硝基苯丙氨酸突变的小鼠RANKL(mRANKL)的胞外段,通过高效液相色谱联合质谱检测验证了p-硝基苯丙氨酸的成功插入;并从中筛选出了两个能够诱导小鼠产生高滴度抗mRANKL抗体的疫苗(Y~(234)pNO_2Phe和Y~(240)pNO_2Phe),用该疫苗免疫小鼠获得的抗血清在体外可抑制RANKL诱导的破骨细胞形成,而且疫苗对OVX骨质疏松小鼠具有一定的治疗效果。这些结果为进一步探究治疗骨质疏松的新方法打下了一定的基础。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：
RANKL 的晶体结构。引自（Lam J, et al. J Clin Invest. 2001, 108(7): 9L 以三聚体的形式发挥生物学功能，其介导的 RANK 聚集是早聚体的 RANKL 与三个受体 RANK 结合，使得 RANK 在细胞表NF 受体相关因子（TRAF）并激活下游的细胞信号分子，如 NF-，Akt 等信号途径，进而激活 NFATcl, c-fos 等相关转录因子，诱成熟和功能[39-41]。因此，RANKL 对于破骨细胞的增殖、分化、或缺的。是，体内自然存在着 OPG/RANKL-RANK 信号通路的“缓刹机胞活性的适度性。骨髓间充质细胞分泌的一种可溶性蛋egerin）可以和 RANKL 结合，但不能向细胞内传递分化信号，的破骨细胞形成及功能，因此 OPG 也被称为“诱骗受体”（decoy/RANKL-RANK 这种正性信号与竞争性阻断效应并存的信号通
图 2 OPG–RANK–RANKL 信号通路简图引自（Nakashima T, et al.Ann NYAcad Sci. 2011 Dec;1240:E13-18.）3. 基于 OPG/RANKL-RANK 信号通路对骨质疏松的治疗基于对骨质疏松发病机制分子水平的研究，研究者们一直致力于寻求靶向阻断RANKL 与 RANK 结合的方法，以实现对骨质疏松性疾病更加有效地治疗。最初用于前期临床研究拮抗 RANKL 的是 OPG-Fc 融合蛋白，但由于其能针对体内内源性OPG 发生中和性免疫应答，形成一种拮抗 OPG 的中和抗体，从而增加了安全风险[51]。为了克服 OPG-Fc 的不足，随着单克隆抗体技术的不断发展和疫苗研究的不断深入，产生了针对 RANKL 免疫治疗骨质疏松的新策略。3.1 重组 OPG 与骨质疏松通过提高 OPG 的水平，竞争性阻断 RANKL 与 RANK 的结合，可以阻止破骨细胞的分化和成熟，从而实现抗骨吸收的作用。尽管 OPG 在体外能高效地抑制破骨细
图 3 苯丙氨酸、酪氨酸与 p-硝基苯丙氨酸的结构。（苯丙氨酸：phenylalanine，相对分子质量为 165.19；酪氨酸：tyrosine，相对分子质量为 181.20；p-硝基苯丙氨酸：p-nitrophenylalanine，相对分子质量为 210.19）。引自（Grunewald J, et al. Proc NatlAcadSci USA. 2008, 105(32): 11276-11280）基于以上背景，本研究依据小鼠 RANKL 的三维晶体结构信息，利用非天然氨基酸插入这一全新的技术对 RANKL 进行定点插入修饰。首先通过 RT-PCR 克隆了具有活性的小鼠 RANKL（mRANKL）的胞外段基因，将编码第 164、234、240、272位氨基酸的密码子突变成能编码 p-硝基苯丙氨酸的密码子（TAG），然后构建原核表达载体并在原核细胞中表达，以 p-硝基苯丙氨酸突变的 mRANKL（pNO2PhemRANKL）为抗原免疫小鼠，成功制备了小鼠抗 mRANKL 的抗血清，这些抗血清均具有较高的抗体滴度和活性；从中筛选出来的第 234、240 位 p-硝基苯丙氨酸突变
【参考文献】
本文编号：2889913
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：
RANKL 的晶体结构。引自（Lam J, et al. J Clin Invest. 2001, 108(7): 9L 以三聚体的形式发挥生物学功能，其介导的 RANK 聚集是早聚体的 RANKL 与三个受体 RANK 结合，使得 RANK 在细胞表NF 受体相关因子（TRAF）并激活下游的细胞信号分子，如 NF-，Akt 等信号途径，进而激活 NFATcl, c-fos 等相关转录因子，诱成熟和功能[39-41]。因此，RANKL 对于破骨细胞的增殖、分化、或缺的。是，体内自然存在着 OPG/RANKL-RANK 信号通路的“缓刹机胞活性的适度性。骨髓间充质细胞分泌的一种可溶性蛋egerin）可以和 RANKL 结合，但不能向细胞内传递分化信号，的破骨细胞形成及功能，因此 OPG 也被称为“诱骗受体”（decoy/RANKL-RANK 这种正性信号与竞争性阻断效应并存的信号通
图 2 OPG–RANK–RANKL 信号通路简图引自（Nakashima T, et al.Ann NYAcad Sci. 2011 Dec;1240:E13-18.）3. 基于 OPG/RANKL-RANK 信号通路对骨质疏松的治疗基于对骨质疏松发病机制分子水平的研究，研究者们一直致力于寻求靶向阻断RANKL 与 RANK 结合的方法，以实现对骨质疏松性疾病更加有效地治疗。最初用于前期临床研究拮抗 RANKL 的是 OPG-Fc 融合蛋白，但由于其能针对体内内源性OPG 发生中和性免疫应答，形成一种拮抗 OPG 的中和抗体，从而增加了安全风险[51]。为了克服 OPG-Fc 的不足，随着单克隆抗体技术的不断发展和疫苗研究的不断深入，产生了针对 RANKL 免疫治疗骨质疏松的新策略。3.1 重组 OPG 与骨质疏松通过提高 OPG 的水平，竞争性阻断 RANKL 与 RANK 的结合，可以阻止破骨细胞的分化和成熟，从而实现抗骨吸收的作用。尽管 OPG 在体外能高效地抑制破骨细
图 3 苯丙氨酸、酪氨酸与 p-硝基苯丙氨酸的结构。（苯丙氨酸：phenylalanine，相对分子质量为 165.19；酪氨酸：tyrosine，相对分子质量为 181.20；p-硝基苯丙氨酸：p-nitrophenylalanine，相对分子质量为 210.19）。引自（Grunewald J, et al. Proc NatlAcadSci USA. 2008, 105(32): 11276-11280）基于以上背景，本研究依据小鼠 RANKL 的三维晶体结构信息，利用非天然氨基酸插入这一全新的技术对 RANKL 进行定点插入修饰。首先通过 RT-PCR 克隆了具有活性的小鼠 RANKL（mRANKL）的胞外段基因，将编码第 164、234、240、272位氨基酸的密码子突变成能编码 p-硝基苯丙氨酸的密码子（TAG），然后构建原核表达载体并在原核细胞中表达，以 p-硝基苯丙氨酸突变的 mRANKL（pNO2PhemRANKL）为抗原免疫小鼠，成功制备了小鼠抗 mRANKL 的抗血清，这些抗血清均具有较高的抗体滴度和活性；从中筛选出来的第 234、240 位 p-硝基苯丙氨酸突变
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 赵燕玲,潘子昂,王石麟,王虔,刘京萍,刘忠厚;中国原发性骨质疏松症流行病学[J];中国骨质疏松杂志;1998年01期
本文编号：2889913
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/nfm/2889913.html
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