过表达ICAM-1对间充质干细胞生物学特性影响及自身免疫性甲状腺炎动物模型的建立

发布时间：2017-04-15 06:07

  本文关键词：过表达ICAM-1对间充质干细胞生物学特性影响及自身免疫性甲状腺炎动物模型的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 1.构建重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1,探讨细胞间粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)基因转染对小鼠间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)生物学特性的影响。为进一步研究ICAM-1是否影响MSCs对自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune Thyroiditis, AIT)体内治疗效果提供实验基础。 2.利用外源性甲状腺球蛋白免疫C57BL/6小鼠建立AIT的动物模型——实验性自身免疫性甲状腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis, EAT),为下一步开展大规模体内实验提供稳定可靠的动物模型。 方法： 1.通过RT-PCR方法扩增获得小鼠脾细胞ICAM-1基因全长DNA,将其克隆至中间载体pMD19-T,行双酶切及DNA测序鉴定后,将ICAM-1基因连接至逆转录病毒载体MIGR1七,对重组载体MIGR1-ICAM-1进行双酶切、RT-PCR及DNA测序分析。 2.将获得的重组逆转录病毒质粒MIGR1-ICAM-1及空质粒MIGR1均加入包装质粒ECOS后分别转染人胚肾细胞(T293细胞),将获得携带ICAM-1基因的逆转录病毒MIGR1-ICAM-1及空载体逆转录病毒MIGR1,分别感染C3H10T1/2细胞,荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达, real-time PCR和流式细胞术检测ICAM-1在基因水平和蛋白水平的表达。同时检测三种细胞的形态、表型、生长特点及成脂成骨分化等一般生物学特性；并通过淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test, LTT)及混合淋巴细胞反应实验(Mixed lymphocyte reaction, MLR)检测三种细胞的免疫学特性。 3.建立EAT动物模型,将5周龄雌性C57BL/6小鼠于第0d和第14d用猪甲状腺免疫球蛋白(Porcine Thyroglobuli, PTg)及弗氏佐剂(Freund's adjuvant, FA)进行两次免疫；于实验第28d眼球取血,测血清甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin Antibody, TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(Antithyroid Peroxidase Antibodies,TPOAb)、甲状腺微粒体抗体(Thyroid microsomal Autoantibody, TMAb)水平,并分离甲状腺组织行HE染色及组织病分析。 结果： 1.对重组载体MIGR1-ICAM-1双酶切和RT-PCR电泳均显示获得1700bpICAM-1目的基因片段；DNA测序结果显示与基因文库中的小鼠ICAM-1基因序列完全相同,且插入方向正确,从而证实成功构建重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1。 2.逆转录病毒感染C3H10T1/2细胞后,荧光倒置显微镜下可见绝大部分细胞表达绿色荧光；real-time PCR和流式细胞术分别在转录水平(相对表达量1625.82+119.42)和蛋白水平(表达量90.3%)证实ICAM-1在C3H10T1/2细胞中均有高表达,从而证明获得稳定过表达ICAM-1的间充质干细胞系C3H10T1/2(C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC)。 3.进一步对过表达ICAM-1的C3H10T1/2细胞的生长特性、诱导分化能力及免疫学功能进行研究,结果表明,过表达ICAM-1可使C3H10T1/2细胞(29.18±2.47)%处于S期,且倍增时间缩短。在成脂诱导分化中,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC获得脂肪细胞数显著降低(12.18±3.83/孔),且脂滴变小；real-time PCR检测成脂分化关键转录因子C/EBPα和PPARy的表达均显著下调；同样,在成骨分化中,过表达ICAM-1可使C3H10T1/2成骨分化的碱性磷酸酶活性及矿化骨结节形成能力显著下降,关键转录因子Runx2和Osteocalcin在mRNA表达水平亦显著降低,提示过表达ICAM-1可显著降低MSCs的成脂和成骨分化能力。 4.利用淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test, LTT)和混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR)对过表达ICAM-1的MSCs进行免疫功能检测,结果显示,在LTT体系中,当MSCs:T细胞分别为1：40和1：5时,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC与对照组C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分别为(1955.25±292.60)、(2285.33±303.67)；(812.00±21.17)、(1335.00±209.18)；同样,在MSCs作为滋养层的MLR反应体系中,当刺激细胞：效应细胞为1：1和1：25时,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC与对照组C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分别为(1598.50±110.74)、(1859.00±111.25)；(1147.50±55.91)、(1493.00±98.33)。提示过表达ICAM-1的MSCs具有显著抑制T细胞增殖的能力,且具有剂量依赖性,随着MSCs数量的增加,其抑制能力逐渐增强。 5.C57BL/6小鼠经外源性甲状腺球蛋白皮下免疫诱导后,结果显示,模型组小鼠血清中TPOAb、TMAb、TgAb的水平[(60.36±4.53)、(67.47±6.25)、(65.67±5.35)]均显著高于对照组小鼠[(21.45±4.66)、(7.68±2.76)、(7.59±2.23)]；甲状腺病理显示滤泡间质存在淋巴细胞浸润情况,具有典型EAT特征。 结论： 1.本研究通过构建ICAM-1的重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1,成功获得稳定过表达ICAM-1的间充质干细胞系C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC。 2.对过表达ICAM-1的MSCs生物学特性研究表明,过表达ICAM-1可使MSCs增殖能力增强、成脂成骨分化能力减弱；最为关键的是,过表达ICAM-1可显著增强MSCs的免疫抑制作用,为进一步研究ICAM-1是否影响MSCs对AIT体内治疗效果提供实验基础。 3.同时本研究利用外源性甲状腺自身抗原免疫方法成功建立EAT,从而证实该实验方法建模成功率高、可行性强并且可重复性高。为下一步的体内实验提供了稳定可靠的动物模型。
【关键词】：间充质干细胞 C3H10T1/2细胞 细胞间粘附分子1 实验性自身免疫性甲状腺炎
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R581.4
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、ICAM-1逆转录病毒载体的构建与鉴定16-31
• 实验流程16-17
• 1.1. 对象和方法17-26
• 1.2. 结果26-29
• 1.3. 讨论29-30
• 1.4. 小结30-31
• 二、过表达ICAM-1对间充质干细胞生物学特性的影响31-60
• 实验流程31-32
• 2.1 对象和方法32-42
• 2.2 结果42-57
• 2.3 讨论57-59
• 2.4 小结59-60
• 三、实验性自身免疫性甲状腺炎模型的建立60-68
• 实验流程60-61
• 3.1 对象和方法61-64
• 3.2 结果64-66
• 3.3 讨论66-67
• 3.4 小结67-68
• 结论68-69
• 参考文献69-75
• 发表论文和参加科研情况说明75-76
• 综述 间充质干细胞的免疫调节与临床应用76-85
• 综述参考文献82-85
• 致谢85

【共引文献】

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本文编号：307766