生长激素缺乏状态下棕榈酸通过线粒体途径加重肝细胞凋亡
发布时间：2021-10-26 00:30
研究背景与目的:成人生长激素缺乏症是由垂体前叶分泌生长激素不足引起的内分泌疾病,常伴有身体成分组成比例改变,脂糖代谢紊乱,导致非酒精性脂肪肝发病率明显高于正常人。我们既往研究表明,生长激素缺乏条件下棕榈酸（PA）可以加重肝细胞的脂质沉积,本研究中,我们探讨生长激素缺乏状态下棕榈酸（PA）增加线粒体氧化应激加重肝细胞凋亡的经典信号通路。方法:构建慢病毒干扰载体下调永生化肝L02细胞生长激素受体（GHR）,PCR法检测GHR的mRNA表达水平,构建稳定低表达GHR的肝L02细胞株。用不同浓度PA（75umol,150umol或300umol）处理肝L02细胞12h,24h,48h,检测细胞活力以筛选最适宜处理条件。将实验分为慢病毒GHR敲低组（shRNAGHR）和空载病毒（Vector）组,使用PA（150umol）干预细胞24h。采用油红“O”,BODIPY荧光染色观察生长激素缺乏的L02肝细胞与对照肝细胞内脂质沉积情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;JC-1检测L02肝细胞内线粒体膜电位的变化;DHE荧光探针检测细胞ROS水平以及MitoSox荧光探针检测线粒体ROS水平,western...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：42 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PA对正常肝L02细胞活力的影响
重庆医科大学硕士研究生学位论文16义链分别为:5’-TACAATAAGGTATCCAGATGG-3’。本研究验证该序列持续有效。如图2所示，转染慢病毒后用PCR技术检测肝L02细胞GHR的mRNA水平，结果表明生长激素受体基因敲低大于70%，差异具有统计学意义（P<0.01），提示低表达生长激素受体的肝细胞模型建立成功。图2：重组慢病毒转染L02细胞抑制GHR表达Fig.2TheefficiencyofLenti-GHRvirustransfectedinL02cell.**meansP<0.012.3敲低GHR对凋亡及ROS的影响凋亡是细胞为维持内环境稳定出现的自发性的死亡过程，是一种主动、高度有序、基因控制、信号依赖以及一系列酶参与的过程，在非酒精性脂肪肝的发生发展中起着重要的作用。氧化应激反应是ROS产生与清除的失调，在细胞内堆积过多，活性氧自由基可以与多不饱和脂肪酸过氧化反应生成过氧化脂质，该过程会导致一系列毒性作用包括细胞内蛋白以及酶变形，DNA氧化修饰，生物膜脂质过氧化，增加细胞对外界刺激的敏感性，从而导致肝细胞更容易发生凋亡。为了探讨敲低GHR对细胞ROS以及凋亡的影响，本研究采用150uMPA处理敲低GHR组与对照Vector组肝L02细胞，在12h，24h和48h检测细胞凋亡水平和ROS水平。本研究用annexvFITC-PI流式细胞术检测凋亡，DHE荧光探针检测细胞内ROS水平。如图3a提示GHR敲低组在12h，24h以及48h的每个时间点凋亡细胞数目均高于对照组，图3b提示GHR敲低组在12h，24h以及48h的每个时间点ROS水平均高于正常对照组，图3c为量化的细胞凋亡水平，图3d量化的细胞ROS水平，差异有统计学意义。*P<0.05,**P<0.01
重庆医科大学硕士研究生学位论文182.4敲低GHR加重肝细胞脂肪沉积图4油红以及BODIPY观察脂质沉积情况Figure4EffectofknockdownGHRonleveloflipiddepositionlevelinPAhepatocyte脂质沉积是细胞凋亡的重要因素，也是细胞发生凋亡的早期特征。本研究通过油红“O”以及BODIPY荧光染色检测肝细胞脂质沉积情况。将敲低组和Vector组细胞种于爬片，用150uM的PA干预细胞24小时。给予PA刺激后GHR敲低组与Vector组相比，肝细胞内油红颗粒聚集更加明显，BODIPY胞质内荧光染色脂质颗粒更丰富，提示PA干预敲低GHR的肝细胞更容易发生脂质沉积。2.5敲低GHR对线粒体膜电位，线粒体内ROS以及ATP的影响线粒体正常的膜电位维持了线粒体正常的功能，线粒体膜电位的去极化代表了线粒体凋亡的早期发生。为了观察敲低GHR对线粒体凋亡以及线粒体ROS的影响，用150uM的PA干预细胞24小时，图4a证实了敲低GHR的肝细胞给予PA刺激后JC-1染色复合体与单体红绿光比率明显下降，提示膜电位去极化损伤更加严重，是发生细胞凋亡早期特征；线粒体内ROS是细胞呼吸的副产品，过量的ROS产生直接会导致线粒体结构功能的损伤，线粒体损伤会导致ROS消耗进一步减少，ATP合成进一步降低，导致细胞进一步损伤直至凋亡。图4b使用特异性线粒体ROS检测试剂mitoSox特异性荧光探针，表明与Vector组相比，敲低GHR组PA干预细胞后线粒体内ROS明显增加。使用ATP化学发光检测试剂盒证实，敲低GHR组与Vector组相比，PA干预细胞后ATP水平明显更低，证实了线粒体功能受损，利用ROS产生ATP的能力下降，细胞内氧自由基清除能力受损，如图4c，差异均有统计学意义。*P<0.05,**p<0.01
【参考文献】：
期刊论文
[1]Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction[J]. R Scott Rector,John P Thyfault,Jamal A Ibdah. World Journal of Gastroenterology. 2008(02)
本文编号：3458469
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：42 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PA对正常肝L02细胞活力的影响
重庆医科大学硕士研究生学位论文16义链分别为:5’-TACAATAAGGTATCCAGATGG-3’。本研究验证该序列持续有效。如图2所示，转染慢病毒后用PCR技术检测肝L02细胞GHR的mRNA水平，结果表明生长激素受体基因敲低大于70%，差异具有统计学意义（P<0.01），提示低表达生长激素受体的肝细胞模型建立成功。图2：重组慢病毒转染L02细胞抑制GHR表达Fig.2TheefficiencyofLenti-GHRvirustransfectedinL02cell.**meansP<0.012.3敲低GHR对凋亡及ROS的影响凋亡是细胞为维持内环境稳定出现的自发性的死亡过程，是一种主动、高度有序、基因控制、信号依赖以及一系列酶参与的过程，在非酒精性脂肪肝的发生发展中起着重要的作用。氧化应激反应是ROS产生与清除的失调，在细胞内堆积过多，活性氧自由基可以与多不饱和脂肪酸过氧化反应生成过氧化脂质，该过程会导致一系列毒性作用包括细胞内蛋白以及酶变形，DNA氧化修饰，生物膜脂质过氧化，增加细胞对外界刺激的敏感性，从而导致肝细胞更容易发生凋亡。为了探讨敲低GHR对细胞ROS以及凋亡的影响，本研究采用150uMPA处理敲低GHR组与对照Vector组肝L02细胞，在12h，24h和48h检测细胞凋亡水平和ROS水平。本研究用annexvFITC-PI流式细胞术检测凋亡，DHE荧光探针检测细胞内ROS水平。如图3a提示GHR敲低组在12h，24h以及48h的每个时间点凋亡细胞数目均高于对照组，图3b提示GHR敲低组在12h，24h以及48h的每个时间点ROS水平均高于正常对照组，图3c为量化的细胞凋亡水平，图3d量化的细胞ROS水平，差异有统计学意义。*P<0.05,**P<0.01
重庆医科大学硕士研究生学位论文182.4敲低GHR加重肝细胞脂肪沉积图4油红以及BODIPY观察脂质沉积情况Figure4EffectofknockdownGHRonleveloflipiddepositionlevelinPAhepatocyte脂质沉积是细胞凋亡的重要因素，也是细胞发生凋亡的早期特征。本研究通过油红“O”以及BODIPY荧光染色检测肝细胞脂质沉积情况。将敲低组和Vector组细胞种于爬片，用150uM的PA干预细胞24小时。给予PA刺激后GHR敲低组与Vector组相比，肝细胞内油红颗粒聚集更加明显，BODIPY胞质内荧光染色脂质颗粒更丰富，提示PA干预敲低GHR的肝细胞更容易发生脂质沉积。2.5敲低GHR对线粒体膜电位，线粒体内ROS以及ATP的影响线粒体正常的膜电位维持了线粒体正常的功能，线粒体膜电位的去极化代表了线粒体凋亡的早期发生。为了观察敲低GHR对线粒体凋亡以及线粒体ROS的影响，用150uM的PA干预细胞24小时，图4a证实了敲低GHR的肝细胞给予PA刺激后JC-1染色复合体与单体红绿光比率明显下降，提示膜电位去极化损伤更加严重，是发生细胞凋亡早期特征；线粒体内ROS是细胞呼吸的副产品，过量的ROS产生直接会导致线粒体结构功能的损伤，线粒体损伤会导致ROS消耗进一步减少，ATP合成进一步降低，导致细胞进一步损伤直至凋亡。图4b使用特异性线粒体ROS检测试剂mitoSox特异性荧光探针，表明与Vector组相比，敲低GHR组PA干预细胞后线粒体内ROS明显增加。使用ATP化学发光检测试剂盒证实，敲低GHR组与Vector组相比，PA干预细胞后ATP水平明显更低，证实了线粒体功能受损，利用ROS产生ATP的能力下降，细胞内氧自由基清除能力受损，如图4c，差异均有统计学意义。*P<0.05,**p<0.01
【参考文献】：
期刊论文
[1]Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction[J]. R Scott Rector,John P Thyfault,Jamal A Ibdah. World Journal of Gastroenterology. 2008(02)
本文编号：3458469
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/nfm/3458469.html
最近更新
教材专著
