miR-455对高糖诱导下人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响

发布时间：2017-07-14 05:17

  本文关键词：miR-455对高糖诱导下人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响

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【摘要】：研究背景糖尿病是21世纪最严重的公共健康挑战之一。2014年国际糖尿病联盟估计全球至少有3.87亿糖尿病患者,到2035年这个数字预计会攀升至约6亿,这意味着世界上每十个成年人中就将有一个糖尿病患者。糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的常见并发症之一和导致终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因。无论是在1型糖尿病还是2型糖尿病中,DKD的发生都与血糖控制不佳有关。高血糖通过非酶途径产生的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)的积聚、蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)和多元醇通路的激活、氧化应激的增强、血管活性物质及细胞因子的激活,激肽释放酶-激肽系统的作用等因素引起组织损伤,各因素之间又相互影响。在高糖状态下,肾小球系膜细胞(mesangial cells,MCs)功能紊乱,引起细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白合成和降解相对失衡而大量堆积于系膜区及基底膜区,使肾小球形态、结构及功能发生病理性变化,最终导致肾小球硬化症的发生。微小RNA(microRNA,miRNA)是一个庞大的小分子调控RNA家族,是约22个核苷酸长度的内源性非编码RNA,其可与靶基因mRNA3’端非转录区域(3'-untranslated region,3'UTR)结合,通过促进mRNA降解或阻断蛋白翻译来调节靶基因表达从而调控机体病理生理过程。miRNA在细胞增殖、生长、分化及凋亡中发挥重要作用。miRNA在不同的组织表达不同,且其表达的变化参与人类多种疾病的发生发展,如糖尿病、肾脏疾病、肿瘤和心血管疾病等。越来越多的证据表明miRNA在与DKD病理改变相关的信号通路中起到调节作用。例如,miR-192可激活TGFβ信号通路导致肾脏纤维化和蛋白尿,miR-21可激活Akt信号通路导致肾脏肥大和纤维化。研究发现推动DKD进展的miRNA在糖尿病肾脏中表达升高,与之相反,表达下降的miRNA有肾脏保护作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated proteinkinase,AMPK)是真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,以异源三聚体的形式广泛存在于真核生物体内,是细胞的能量感受器,在能量代谢调控中起极其重要的作用。肝酶BI (liver kinase BI,LKBI)、Ca2+/CaM-依赖蛋白激酶激酶P(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase β,CaMKKβ)和AMP/ATP或ADP/ATP比值升高均可以激活AMPK,进而调节细胞的能量代谢网络,提高其应对内外环境变化的能力,从而维持细胞水平乃至整个机体的稳定状态。活化的AMPK可以增强分解代谢,抑制合成代谢,上调ATP水平,参与细胞糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢等能量代谢过程,增加细胞能量储备,应对能量缺乏。同时活化的AMPK参与细胞的生长、增殖、凋亡、自噬等基本生物学过程。AMPK是研究糖尿病和肥胖等能量代谢性疾病的核心。肾脏中的AMPK活性降低可能会引起糖尿病患者和肥胖患者中的肾脏损害。另外,AMPK的激动剂5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-dribofuranoside,AICAR)可显著改善Akita小鼠的肾脏损害和减少蛋白尿。我们在前期研究中发现miR-455能促进棕色脂肪分化,ap2-miR-455转基因小鼠可对抗高脂饮食诱导的肥胖及糖耐量异常。miR-455可通过其靶基因HIF1AN激活AMPK信号通路。我们还发现miR-455在肾脏的表达仅次于脂肪。最近一项研究发现,miR-455在5ng/ml TGF-β处理的足细胞中降低57.2%,提示miR-455可能参与DKD的发生发展。综上所述,我们推测,miR-455可能在糖尿病肾病的防治中具有重要价值,且目前尚未见有关miR-455与DKD之间的相关性的报道。因此,本研究以体外人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)为模型,观察miR-455对系膜细胞增殖水平、ECM蛋白表达和AMPK信号通路的影响,并通过调节AMPK的活性观察其对系膜细胞以上指标的影响,继而探讨AMPK信号通路在此过程中可能发挥的作用。研究目的探讨miR-455对高糖诱导下人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响及其可能机制研究方法细胞培养冻存的HMCs在37℃中水浴1分钟内复苏,培养于含10%胎牛血清的DMEM低糖(5.6mmol/L, LG)培养基中,并在37℃、5%C02培养箱中孵育。每2-3天更换新的培养基。细胞增殖(CCK-8)检测细胞接种于96孔培养板中,使每孔含细胞约2×103个。先用含1%胎牛血清的培养基培养24h,使细胞同步于静止期,后施加刺激。终止前1h在每个孔内加入CCK-8溶液10μL,混匀后37℃继续孵育1h,酶标仪450nm波长处检测OD值。细胞转染细胞接种于6孔板或12孔板中,转染时每孔的细胞密度约为25%。采用阳离子脂质体法进行瞬时转染,操作按Lipofectamine(?)3000转染试剂说明书进行。基因实时荧光定量PCR (qRT-PCR)提取细胞总RNA,在Nano Drop ND-1000分光光度计上进行核酸定量。按M-MLV逆转录酶说明书逆转录cDNA。SYBR Select Master Mix用于实时荧光定量PCR反应。PCR反应在罗氏480PCR仪上进行。基因表达量按2-AACt方法计算得出。P-actin作为内参基因。miRNA实时荧光定量PCR (qRT-PCR)按miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书提取micro RNA。按miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒提取分离试剂盒说明书合成第一链。按miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒说明书配制PCR反应液。PCR反应在罗氏480PCR仪上进行。以U6作为内参,采用2-ΔΔCt方法进行相对定量,计算niR-455 mRNA的相对表达量。Western blotting提取细胞总蛋白。BCA法测定样品蛋白浓度。灌制8%或10%的分离胶与5%的浓缩胶,将变性后的样品蛋白电泳分离,切下目的蛋白所在的凝胶,转移目的蛋白到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉或5%BSA的TBST封闭PVDF膜1h,将一抗(1：1000)稀释后与PVDF膜在4℃摇床上过夜孵育。再与荧光二抗(1：15000)避光孵育1h。在Odyssey近红外成像系统进行发光显影,并用凝胶图像分析系统(Quantity One 4.4.0)分析结果。统计学分析获得的数据均以均数±标准差表示,统计及分析过程利用统计软件SPSS 20.0完成。两个独立样本均数的比较使用T检验,多个样本均数的比较使用One-Way ANOVA,方差齐性的数据使用LSD法进行多重比较,方差不齐的数据使用Welch法进行近似方差分析,使用Dunnett's T3法进行多重比较,认为P0.05为差异具有统计学意义。结果高糖对HMCs功能及AMPK信号通路的影响细胞增殖实验显示：高糖(30mmol/L, HG)孵育24h、48h、72h后,与低糖组(5.6 mmol/L, LG组)相比,均可明显促进系膜细胞增殖。与低糖组相比,高糖组孵育48h可使细胞纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)和胶原蛋白I(CollagenI,COLI)的mRNA和蛋白表达明显升高,可使细胞磷酸化AMPK (PAMPK)、磷酸化ACC (PACC)蛋白表达明显降低。与低糖组相比,高渗对照组(甘露醇24.4 mmol/L+D-葡萄糖5.6 mmol/L, Man组)相关指标无明显变化。高糖对HMCs miR-455 mRNA表达量的影响qRT-PCR检测发现孵育HMCs 48h后,与低糖组相比,高糖组miR-455的mRNA表达量明显降低,高渗对照组无明显变化。miR-455模拟物、抑制物对HMCs miR-455 mRNA表达量的影响qRT-PCR检测发现,转入miR-455模拟物(miR-455 mimic)组的miR-455表达量明显高于对照组,而转入miR-455抑制物(miR-455 inhibitor)组的miR-455表达量明显低于对照组,说明转染成功。miR-455模拟物、抑制物对HMCs功能的影响与HG+scramble组相比,HG+miR-455 mimic组细胞增殖水平及FN、COLI蛋白表达明显降低。与HG+scramble组相比,HG+miR-455 inhibitor组细胞增殖水平及FN、COLI蛋白表达进一步明显升高。miR-455模拟物、抑制物对HMCs AMPK信号通路的影响与HG+scramble组相比,HG+miR-455 mimic组细胞PAMPK、PACC蛋白表达明显升高。与HG+scramble组相比,HG+miR-455 inhibitor组细胞PAMPK、 PACC蛋白表达进一步明显下降。抑制AMPK对高糖刺激下过表达miR-455的HMCs功能的影响过表达miR-455及1 mmol/L AICAR预处理均可明显抑制细胞的增殖(与HG组相比)。此外,10μmol/L compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的抑制作用,促进细胞增殖。过表达miR-455及1 mmol/L AICAR预处理均可明显抑制FN和COLI蛋白的表达(与HG组相比),此外,10μmol/L compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的抑制作用,增加FN和COLI蛋白的表达。抑制AMPK对高糖刺激下过表达miR-455的HMCs AMPK信号通路的影响过表达miR-455及1mmol/L AICAR预处理均可明显促进细胞PAMPK和PACC蛋白的表达(与HG组相比)。此外,10μmol/L compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的促进作用,抑制PAMPK和PACC蛋白的表达。激活AMPK对高糖刺激下抑制miR-455的HMCs功能的影响抑制miR-455可明显进一步促进细胞的增殖(与HG组相比)。此外,1mmol/L AICAR预处理可明显减弱抑制miR-455表达的促进作用,抑制系膜细胞的增殖。抑制miR-455可明显进一步增加细胞FN和COLI蛋白的表达(与HG组相比)。此外,1mmol/L AICAR预处理可明显减弱抑制miR-455表达的促进作用,抑制FN和COLI蛋白的表达。激活AMPK对高糖刺激下抑制miR-455的HMCs AMPK信号通路的影响抑制miR-455可明显进一步抑制细胞PAMPK和PACC蛋白的表达(与HG组相比)。此外,lmmol/L AICAR预处理可明显减弱抑制miR-455表达的抑制作用,增加PAMPK和PACC蛋白的表达。结论1.体外高糖培养可明显促进HMCs增殖及FN、COLI蛋白表达,抑制AMPK和ACC磷酸化,抑制miR-455表达；2.过表达miR-455可明显抑制高糖诱导的细胞增殖及FN、COLI蛋白的表达,并促进AMPK和ACC磷酸化。而Compound C预处理可明显减弱过表达miR-455的作用。3.抑制miR-455表达可明显促进高糖诱导的细胞增殖及FN、COLI蛋白的表达,并抑制AMPK、ACC磷酸化。而AICAR预处理可明显减弱抑制miR-455的作用。
【关键词】：人系膜细胞 细胞外基质 细胞增殖 高糖 AMPK
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-24
• 第一章 高糖对人肾小球系膜细胞功能、AMPK信号通路及miR-455的影响24-45
• 第1节 实验材料24-30
• 第2节 实验方法30-38
• 第3节 实验结果38-44
• 第4节 讨论44-45
• 第二章 miR-455对人肾小球系膜细胞功能及AMPK信号通路的影响45-59
• 第1节 实验材料45-46
• 第2节 实验方法46-47
• 第3节 实验结果47-57
• 第4节 讨论57-59
• 第三章 miR-455通过激活AMPK改善高糖刺激下人肾小球系膜细胞功能的分子机制59-71
• 第1节 实验材料59-60
• 第2节 实验方法60
• 第3节 实验结果60-69
• 第4节 讨论69-71
• 全文小结71-73
• 参考文献73-86
• 附录86-88
• 成果88-89
• 致谢89-90

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本文编号：539804