糖尿病性大鼠膀胱平滑肌表型转化的实验研究

发布时间：2017-08-17 17:20

  本文关键词：糖尿病性大鼠膀胱平滑肌表型转化的实验研究

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【摘要】：背景与目的糖尿病为严重危害人类健康的常见病和多发病,是一种慢性全身性代谢疾病,2013年调查研究显示中国成年人糖尿病患病率为11.6%。同时,超过50%的糖尿病患者合并有膀胱功能障碍。糖尿病所致的膀胱功能障碍为泌尿外科常见疾病,既往考虑存在三种病理改变,即：膀胱感觉功能下降、膀胱容量增加和膀胱排空功能下降致残余尿量增多,然而临床上可表现为明显的下尿路症状,包括膀胱过度活动综合症(尿频、尿急)、排尿功能障碍、尿潴留等。临床研究报道22.5%糖尿病患者中存在膀胱过度活动综合症,其中有48.0%伴有尿失禁。目前,糖尿病并发膀胱功能改变的诊断以尿动力学检查结果为基础,治疗目标为缓解症状、预防与治疗泌尿系感染及提高膀胱排空效率,治疗方法包括行为治疗、药物与手术治疗。然而糖尿病对膀胱的影响因素为多方面的,糖尿病所致的膀胱功能障碍伴有多种病理生理变化,其中以逼尿肌改变、神经损害以及尿路上皮损害为糖尿病对膀胱主要的影响因素。糖尿病所致的膀胱功能障碍的发病机制复杂,明确糖尿病所致的膀胱功能障碍的发病机制、寻求有效的治疗措施具有重要的意义。膀胱壁从内到外由三层组织组成,分别为粘膜层,肌层和外膜层。肌层亦称为逼尿肌,主要由平滑肌细胞组成,当逼尿肌收缩,可使膀胱内压升高,导致尿液由尿道排出。平滑肌细胞通过独特的生理机能和收缩性能调节血管的压力、胃肠功能以及泌尿生殖系统的功能。相对于横纹肌细胞,平滑肌细胞具有收缩型和增殖型两种类型,收缩型的主要功能是收缩和舒张,在维持组织器官的正常形态结构和功能上起着重要的作用,而增殖型主要在细胞增生、迁移、降解胞外蛋白及分泌等方面发挥作用,平滑肌细胞具有根据细胞的局部环境变化重塑其表型双向分化的能力。当机体受到某些因素刺激,平滑肌细胞由收缩型向合成型转化的过程,称为表型转化。膀胱平滑肌与血管平滑肌在结构和功能上类似,研究报道膀胱平滑肌细胞也可以发生表型转化。有研究对膀胱出口梗阻的患者及兔模型取材检测,发现膀胱出口梗阻时膀胱平滑肌存在表型转化,提示膀胱平滑肌表型转化参与了膀胱出口梗阻后膀胱功能障碍发病的病理生理机制。糖尿病是否引起膀胱平滑肌表型转化,目前还未见相关报道。平滑肌细胞由收缩型向增殖型转化,这种表型转化主要表现为细胞增殖率、迁移率增加,炎症因子和细胞收缩相关基因,如SMA,SMMHC,肌滑蛋白(smoothelin),碱性调宁蛋白(calponin)及结蛋白等表达下降。平滑肌细胞根据机体在发育的不同阶段或不同疾病状态下所发生的形态、结构和功能的转变为平滑肌细胞的表型转化。nyocardin属于SAP(SAF-A/B,Acinus,PIAS)核蛋白超家族成员,通过与血清应答因子(SRF)及CArG反应元件形成三元复合物,激活一系列受SRF调控、可编码细胞支架蛋白和收缩相关蛋白的基因转录,从而调控平滑肌细胞表型转化。Myocardin为平滑肌细胞表型调控过程中重要的调控因子,有研究证明myocardin是平滑肌细胞保持收缩型表型的必须因子,myocardin具有调控平滑肌细胞表型转化的能力,组织中myocardin表达量与收缩型平滑肌细胞成正比,平滑肌细胞收缩表型的维持依赖于myocardin的功能激活。同时,本课题组前期研究表明,myocardin在阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化过程中起关键作用,糖尿病ED的大鼠阴茎海绵体中myocardin明显下降,并且阴茎海绵体过表达myocardin能够逆转阴茎海绵体平滑肌细胞的表型转化和改善糖尿病性ED大鼠的勃起功能。综上所述,我们猜想,糖尿病性大鼠膀胱平滑肌组织中是否也存在myocardin表达下调,进而出现表型转化的现象。由于关于糖尿病是否引起膀胱平滑肌细胞表型转化未见报道,因此,本研究通过测定糖尿病性大鼠膀胱平滑肌中myocardin、α-SMA、SMMHC的表达变化来初步探讨糖尿病性大鼠膀胱平滑肌表型转化的情况,为糖尿病所致膀胱功能障碍的治疗提供理论基础和新靶标。方法利用链脲佐菌素诱导Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立和取材Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立：按照我们已报道的方法,32只SPF级8周龄体质量200-220g雄性SD大鼠适应性喂养1周后平均随机分成糖尿病组和非糖尿病组。禁食不禁水12h后,糖尿病组大鼠按60mg/kg体重一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(60mg/kg,溶于pH4.5,0.1mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)建立糖尿病模型。正常组大鼠腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照。72h后取尾静脉血,测定大鼠随机血糖,以大鼠明显消瘦,多饮、多尿,随机血糖水平16.6mmol/L为糖尿病动物建模成功标准。所有的SD大鼠在温度恒定(25±1oC)和光线12h循环中喂养,定期更换洁净垫料。9周后,分别取出糖尿病组和正常对照组大鼠的膀胱,排空膀胱内尿液,称取各组的膀胱湿重后反复用PBS液清洗,一部分予4%多聚甲醛溶液固定,一部分剔除膀胱的浆膜层和粘膜层,置入液氮速冻后放入-80℃超低温冰箱保存备用。1.膀胱组织HE染色和Masson's Trichrome染色9周后,分别对糖尿病性大鼠和正常对照大鼠膀胱组织进行HE染色、Masson's Trichrome染色,观察各组膀胱组织的形态结构变化。1.分别测定Myocardin生糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达。9周后,使用qRT-PCR和western blot分别检测myocardin在糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达,并比较两组间myocardin的表达差异。2.分别测定α-SMA在糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达。9周后,使用qRT-PCR和western blot分别检测α-SMA在糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达,并比较两组间a-SMA的表达差异。3.分别测定SMMHC在糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达。9周后,使用qRT-PCR和western blot分别检测SMMHC在糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达,并比较两组间SMMHC的表达差异。统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析,数据均以均值±标准差表示,两组间差异的比较用两个独立样本t检验,P0.05为差异有统计学意义。结果1、成功建立链脲佐菌素诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠模型造模前,初始体重比较,糖尿病组大鼠体重(215.9±25.0g)与正常对照组大鼠体重(218.7±28.8g)无明显差异(P0.05)；造模后,糖尿病大鼠较正常对照组大鼠明显消瘦,出现多饮、多尿,造模9周时,糖尿病组大鼠体重(286.3±71.2g)比正常对照组大鼠(412.7±102.7g)明显下降,有统计学差异p=0.001,糖尿病组大鼠膀胱湿重(0.34±0.19g)比正常对照组大鼠(0.15±0.05g)明显增高,有统计学差异(p=0.002),造模过程中,糖尿病组大鼠出现2只死亡,而正常对照组大鼠无死亡。2、各组膀胱组织HE染色和Masson's Trichrome染色通过HE染色,观察糖尿病组大鼠与正常对照组大鼠的膀胱组织形态结构变化,结果发现：糖尿病组膀胱平滑肌细胞排列紊乱、细胞外基质沉积,结构松散,而正常对照组膀胱组织平滑肌细胞排列整齐紧密,细胞外充满结缔组织。利用Masson's Trichrome染色来观察两组间膀胱组织的平滑肌细胞质与细胞外基质的变化,结果发现糖尿病组大鼠膀胱组织较正常组平滑肌细胞质减少,细胞外纤维化增多。4、myocardi、α-SMA、SMMHC分别在糖尿病组大鼠和正常对照组大鼠膀胱组织中的表达水平差异荧光定量PCR检测结果显示,与正常对照组比较,糖尿病组大鼠膀胱组织中myocardin mRNA表达显著下调(P0.05)；同时收缩型相关蛋白α-SMAmRNA表达明显下调(P0.05)和SMMHC mRNA表达明显下调(P0.05)；western blotting检测结果显示,与正常对照组相比,糖尿病组大鼠膀胱组织中myocardin蛋白表达减少(P0.05)；同时收缩型相关蛋白α-SMA蛋白表达减少(P0.05)和SMMHC蛋白表达减少(P0.05)。可见,糖尿病组大鼠膀胱组织中存在Myocardin及收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC表达的下调现象,进而说明糖尿病性大鼠膀胱组织中平滑肌细胞发生表型转化。结论1、造模9周后,糖尿病性大鼠较正常对照组大鼠明显消瘦,伴有多饮、多尿,糖尿病性大鼠膀胱湿重较正常对照组增加,提示糖尿病性大鼠膀胱可能出现病理变化和舒缩功能障碍。2、造模9周时,收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC在糖尿病性大鼠膀胱平滑肌组织中表达下降,提示糖尿病性大鼠膀胱组织中平滑肌细胞发生表型转化,可能参与引起膀胱平滑肌舒缩障碍的病理生理机制。3、myocardin在糖尿病性大鼠膀胱平滑肌组织中表达下降,myocardin的表达下降可能参与了糖尿病性大鼠膀胱组织中平滑肌细胞的表型转化的过程。
【关键词】：糖尿病 膀胱平滑肌 myocardin 表型转化
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R694
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 第一章 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立和取材23-27
• 1. 实验材料23-24
• 2. 结果和附图24-27
• 第二章 糖尿病性大鼠膀胱组织的形态结构变化27-33
• 1. 糖尿病大鼠与正常对照组膀胱组织的HE染色27-29
• 2. 糖尿病大鼠与正常对照组膀胱组织的masson染色29-33
• 第三章 MYOCARDIN和收缩型相关蛋白标志物A-SMA,SMMHC在糖尿病性大鼠膀胱平滑肌组织中的表达及意义33-48
• 1 实验材料33-37
• 2. qRT-PCR方法检测大鼠膀胱组织中α-SMA,SMMHC和myocardinmRNA的表达37-40
• 3 利用Western Blots方法检测大鼠膀胱组织中myocardin,α-SMA和SMMHC的蛋白表达水平40-44
• 4 实验结果分析和统计学处理44
• 5 结果和附图44-48
• 第四章 讨论48-54
• 1. 利用链脲佐菌素构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型50
• 2. 糖尿病性大鼠与正常对照组膀胱组织的HE染色和masson染色50-51
• 3. 糖尿病性大鼠膀胱平滑肌组织中收缩相关型标记物的表达水平变化51-52
• 4. 糖尿病性大鼠膀胱平滑肌组织中myocardin的表达水平变化52-54
• 第五章 全文小结54-55
• 参考文献55-64
• 缩写词简表64-65
• 硕士研究生期间发表论文情况65-66
• 致谢66-68

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本文编号：690209