HB-13对HaCaT细胞分泌细胞因子IL-10及IFN-γ的影响

发布时间：2018-05-01 10:38

  本文选题：HB-13 + P物质　； 参考：《兰州大学》2010年硕士论文

【摘要】： 目的： (1)体外培养人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞),以P物质刺激,为下一步研究小檗碱衍生物HB-13的抗炎机制提供体外细胞模型。 (2)确定小檗碱衍生物HB-13作用于角质形成细胞(HaCaT)的安全浓度。 (3)研究HB-13对HaCaT细胞分泌细胞因子白细胞介素10(IL-10)及干扰素-y (IFN-y)的影响,以期探讨HB-13的抗炎机制。 方法： 第一部分使用DMEM/F12培养基体外培养人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞获赠于西京医院皮肤科),于37℃、5%CO2培养箱中孵育,显微镜下观察细胞完全贴壁,生长良好时,加入不同药物浓度(2.5、5、10、20、40、80μg/mL)的小檗碱衍生物HB-13作用于HaCaT细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法确定HB-13作用于HaCaT细胞的安全浓度。 第二部分以P物质(1×10-8mol/L)刺激HaCaT细胞,应用ELISA法检测不同时间点(12h、24h、48h)培养上清液中IL-10及IFN-y的含量,检测体外细胞模型是否建立成功。 第三部分基于前期的准备和研究,以P物质刺激HaCaT细胞,加入安全浓度(分别为2.5、5、10μg/mL)的HB-13共孵育12、24、48h,应用ELISA法检测不同时间点培养上清液中IL-10及IFN-y的含量；应用免疫细胞化学方法检测细胞内IL-10及IFN-y蛋白的表达；同时收集细胞提取总RNA，，通过荧光定量PCR法检测不同时间点细胞内IL-1OmRNA及IFN-y mRNA表达情况。以雷公藤内酯醇(T0)作为阳性对照。 实验数据采用SPSS 11.5软件进行统计分析。 结果： (1)人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)体外培养形态观察结果：细胞呈圆形、椭圆形或梭型及不规则形状,与有关文献报道相一致； (2)HB-13浓度为2.5、5、10、20、40、80μg/mL时,吸光度值分别为0.982±0.041,0.980±0.043,0.979±0.042,0.728±0.052,0.564±0.053,0.323±0.053；无药对照细胞组吸光度值为0.982±0.037；经统计学分析,HB-13浓度在2.5、5、10μg/mL时,吸光度值与正常组相比无统计学差异(p0.05)；HB-13浓度在20、40、80μg/mL时,吸光度值与正常组相比有统计学意义(p0.01)；提示HB-13浓度在20、40、80μg/mL时对HaCaT细胞有一定的毒性作用。因此,本研究选择2.5、5、10μg/mL为HB-13的安全浓度； (3)以P物质刺激HaCaT细胞,分别加入2.5、5、10μg/mL的HB-13共孵育12、24、48h,HB-13可促进P物质诱导的IL-10的分泌。与对照组雷公藤内酯醇(T0)相比,2.5μg/mL的HB-13在12、24h时其促进IL-10分泌水平低于To(p0.05)；随着HB-13浓度增加(5.10μg/mL)及时间的延长,其促进IL-10分泌水平明显高于T0(p0.01)。各组间相比亦有显著性差异(p0.05)。ELISA法检测培养上清液中IL-10蛋白的表达水平及荧光定量PCR法检测IL-10mRNA水平其变化结果相一致；免疫细胞化学示IL-10的在HaCaT细胞的胞浆中表达,其变化水平与上述检测水平结果相一致； (4)细胞经P物质刺激后,分别加入2.5、5、10μg/mL的HB-13共孵育12、24、48h，HB-13可促进P物质诱导的IFN-γ的分泌。与对照组雷公藤内酯醇(T0)相比,HB-13促进IFN-γ分泌的作用更强(p0.01),但无药物浓度和作用时间的差异(p0.05)。ELISA法检测培养上清液中IFN-γ蛋白的表达水平及荧光定量PCR法检测IFN-ymRNA水平其变化结果相一致；免疫细胞化学示IFN-γ的在HaCaT细胞的胞浆中表达,其变化水平与上述检测水平结果相一致。结论： (1)浓度为2.5、5、10μg/mL的小檗碱衍生物HB-13是作用于HaCaT细胞的安全浓度； (2)HB-13的抗炎作用部分可能是通过促进细胞因子IL-10及IFN-γ的分泌而实现的。
[Abstract]:Objective:
(1) the human immortalized keratinocytes (HaCaT cells) were cultured in vitro, which was stimulated by substance P to provide an in vitro cell model for the study of the anti-inflammatory mechanism of berberine derivative HB-13.
(2) determine the safe concentration of berberine derivative HB-13 acting on keratinocytes (HaCaT).
(3) to study the effect of HB-13 on the secretion of cytokines, interleukin 10 (IL-10) and interferon -y (IFN-y) in HaCaT cells, in order to explore the anti-inflammatory mechanism of HB-13.
Method锛

本文编号：1829002