降钙素基因相关肽刺激角质形成细胞分泌趋化因子CCL27及其机制的相关研究

发布时间：2018-10-05 07:16

【摘要】：背景银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,其病因和发病机制尚不清楚,目前认为是一种在多基因遗传背景下、受多种内外环境因素刺激和诱导的慢性复发性炎症性皮肤病,以角质形成细胞(keratinocyte, KC)过度增生、新生血管形成、炎细胞浸润为其组织病理改变的三要素。在银屑病的组织病理变化中真皮乳头血管的异常最先发生,而后出现炎症细胞的移行和表皮增生及分化异常,由此启动银屑病发生发展过程。同时,大量的免疫活性细胞如：T淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞及其分泌的细胞因子渗出到血管外的组织中,诱导KC活化、增殖并分泌大量细胞因子、粘附分子、趋化因子等,反过来促进血管异常的加重,由此形成细胞因子相互调控的恶性循环,促进疾病的进展。趋化因子(chemokine, CK)是一类特异性地吸引白细胞的小分子蛋白质,分为C、CC、CXC和CX3C四个亚族。趋化因子通过靶细胞膜上的趋化因子受体(ckemokine receptor)起作用。目前研究认为,趋化因子及其受体结合,是调节淋巴细胞迁移的主要刺激因子,除此之外,它在神经传导、新生血管生成及炎性反应调节方面也发挥重要作用。多种趋化因子及其受体参与了银屑病的发病。研究表明,趋化因子在银屑病的表皮角质形成细胞中高表达,KC是这些趋化因子的主要来源。在经UVB、阿维A及依那昔普等治疗银屑病时,随其临床表现的改善,KC表达趋化因子明显下降。 CCL27亦称人皮肽T细胞虏获趋化因子(Cutaneous T cell-attracting chemokine,CTACK)主要由皮肤角质形成细胞产生,仅对皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)阳性记忆性T细胞具有较强的趋化作用。CCR10是CCL27的唯一受体,CCL27/CCR10的相互作用在T细胞介导的皮肤炎性反应中发挥关键作用。CCL27及CCR10在银屑病患者皮损表达明显增多,且表达水平与PASI评分呈明显正相关,提示CCL27参与了银屑病的发病过程,其表达水平与银屑病的病情严重程度有一定相关性。CCL27通过吸引更多的CCR10+/CLA+记忆性T细胞聚集于皮肤,在角质形成细胞和T细胞之间起了一定的桥梁作用,使银屑病皮肤的炎性反应加重和持续。临床观察发现,剧烈的精神刺激或应激反应可诱发和加重银屑病。既往研究发现神经肽广泛存在于皮肤神经纤维和多种皮肤细胞如KC、朗格汉斯细胞、黑素细胞和淋巴细胞、单核细胞等,同时上述细胞表面均分布有神经肽的受体。由于神经系统与皮肤免疫系统多种靶细胞之间有密切联系,伸入皮肤的感觉神经末梢释放的神经肽与表皮和真皮多种细胞接触,可直接修饰角质形成细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞、真皮微血管内皮细胞和浸润的免疫细胞,影响这些细胞的增殖和活化以及细胞因子的产生和抗原呈递,在银屑病发病过程中发挥重要作用。神经肽CGRP是人皮肤组织中重要的神经递质,含37个氨基酸残基,由降钙素基因编码,有较强的舒张真皮微血管作用,能刺激人皮肤微血管内皮细胞活化,使其分泌趋化因子IL-8；诱导内皮细胞与单核细胞及中性粒细胞的粘附作用。此外,CGRP能上调角质形成细胞(KC)表达IL-1,诱导单核细胞合成IL-8及MCP-1,增强对中性粒细胞和T淋巴细胞的趋化作用；还可促进HaCaT细胞表达nNOS和释放NO,参与皮肤内微血管扩张和神经源性炎症反应。早已证实,在某些与精神因素相关的疾病如银屑病等皮损及血浆中神经肽CGRP的表达量显著增加,局部皮损CGRP阳性神经纤维数量也增加,提示CGRP可能在银屑病的发病过程中扮演重要角色。 CGRP作用于CGRP受体后有多种信号途径。包括环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphatec, cAMP),细胞内游离钙离子(Intracellular Ca2+)和丝裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase MAPK)及NF-κB等信号通路。业已证实,CGRP可以作为丝裂原刺激KC增殖,并促进皮损局部血管内皮增生,从而参与银屑病的发生发展过程,而CGRP是否参与银屑病炎细胞的趋化过程,CGRP是否促进KC对炎细胞的趋化活性尚未见报道。因此,本研究拟在体外培养的永生化人角质形成细胞株-HaCaT细胞中,以主要由KC细胞分泌的趋化因子CCL27为主要指标,观察CGRP对HaCaT细胞表达CCL27的影响及其可能的细胞内信号转导机制,以阐明CGRP在银屑病发病、发展中作用机制。目的 1、观察CGRP对人角质形成细胞株-HaCaT细胞趋化淋巴细胞的影响。 2、观察CGRP对HaCaT细胞分泌和表达趋化因子CCL-27的影响。 3、探讨ERK1/2、p38MAP、IκB-α/NF-κB信号途径在CGRP诱导HaCaT细胞分泌趋化因子CCL27中的作用。方法 1.HaCaT细胞的培养：HaCaT细胞用含10%FBS的DMEM放置370C、5%C02培养箱中进行培养。 2.分别分离银屑病及健康对照外周血T淋巴细胞。 3.实验设计 1)HaCaT细胞给予CGRP孵育,部分给予CGRP8-37、PD98059、SB203580、 PDTC预处理,运用Transwell系统观察检测CGRP对T淋巴细胞趋化功能的影响。 2)HaCaT细胞给予不同浓度CGRP孵育,部分给予CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERKI/2阻断剂PD98059、p38MAPK阻断剂SB203580、IκB-α阻断剂PDTC预处理测定HaCaT细胞分泌趋化因子CCL-27mRNA及蛋白表达； 3) HaCaT细胞给予CGRP孵育,部分给予CGRP8-37、PD98059、SB203580或PDTC测定ERK1/2、p38磷酸化及IκB-α改变； 4.实验方法 4.1Transwell系统检测CGRP对T淋巴细胞趋化功能的影响。分离进展期银屑病患者及健康对照外周血T淋巴细胞,加入PHA (200ng/ml)预先孵育6h使淋巴细胞活化,加入含5%牛血清白蛋白的RPMI-1640培养液制备细胞悬液,用24孔趋化小室检测淋巴细胞趋化活性。 4.2实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测CCL27mRNA表达。将所收集的细胞提取总RNA,经逆转录反应得到cDNA,以管家基因β-actin作为参照,通过RT-PCR技术检测CCL27mRNA的表达。 4.3双抗体夹心ELISA法检测CCL27蛋白表达将所收集的细胞培养上清进行孵育、酶反应、显色等步骤,酶联免疫检测仪450nln处测量各孔吸光值,根据标准曲线计算出相应浓度。 4.4Westernblot检测磷酸化ERK1/2、p38及IκB-α蛋白表达将所收集的细胞提取总蛋白,经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜、蛋白印迹、DAB显色、凝胶成像系统成像、ImageTool(IT)3.0进行进行半定量分析,检测p-ERK1/2、p-p38、IκB-α蛋白的表达。结果 1. CGRP促进HaCaT细胞对淋巴细胞的趋化活性神经肽CGRP在一定程度上,能促进HaCaT细胞对淋巴细胞趋化活性,银屑病组及健康对照组其趋化指数CI分别为6.65±0.21和4.25±0.16,两组间比较有统计学意义(p0.05)；用CGRP3-87、PD98059、SB203580、PDTC预处理后,可以使CGRP对HaCaT细胞趋化淋巴细胞的活性明显减弱,银屑病组趋化指数CI分别为2.52±0.26、2.82±0.05、2.02±0.17、2.89±0.14；健康对照组趋化指数C1分别为1.57±0.11、1.74±0.03、1.65±0.08、1.82±±0.04。 2.不同浓度的CGRP对HaCaT细胞CCL27mRNA表达和蛋白分泌的影响 CGRP呈浓度依赖性促进CCL27mRNA和蛋白表达,与正常对照组比较差异有统计学意义(p0.01),其中CGRP浓度为10nM时CCL27mRNA和蛋白表达最高。 3. CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC对CGRP诱导的HaCaT细胞CCL27mRNA表达和蛋白分泌影响 CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC预处理后,CGRP诱导的HaCaT细胞CCL27mRNA及蛋白表达均明显降低(p0.01)；但仍高于正常对照组(p0.01)。 4. ERK1/2、P38MAPK、IκB-α/NF-κB信号转导途径在CGRP促HaCaT细胞表达CCL27中的作用 CGRP在一定范围内时间依赖性促进ERK1/2、P38的磷酸化,CGRP8-37预处理组p-ERK1/2、p-38表达明显降低,PD98059预处理组p-ERK1/2表达明显降低,SB203580预处理后p-38表达明显降低。 CGRP在一定范围内时间依赖性促进IκB-α的磷酸化降解,CGRP在作用10min后IκB-α开始降解,60min内未见表达；CGRP8-37及PDTC预处理明显抑后明显抑制CGRP诱导的IκB-α降解。结论 1、CGRP能促进HaCaT细胞对活化淋巴细胞的趋化活性； 2、CGRP可以上调HaCaT细胞CCL27mRNA和蛋白表达； 3、CGRP可以时间依赖性活化HaCaT细胞ERK1/2、p38MAPK、 IKB-a/NF-KB信号途径； 4、ERK1/2、p38MAPK、IκB-α/NF-κB信号途径可能参与了CGRP上调HaCaT细胞CCL27表达的调控机制。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R758.63

【参考文献】