Rictor在黑色素瘤血管生成拟态中的作用研究

发布时间：2019-04-23 18:31

【摘要】：研究目的:血管生成拟态(vasculogenic mimimcry,VM):是一种非内皮细胞依赖性的肿瘤内血管生成模式,是高侵袭性肿瘤细胞,通过自身变形和基质重塑而围成的血管样通道,管壁由一层PAS阳性基底膜围成,外衬以肿瘤细胞,管道内有血液流动。VM的形成可使肿瘤细胞达到自身血液供应的目的。VM常见于黑色素瘤、胃肠道间质瘤、卵巢癌、乳腺癌等高侵袭性肿瘤中。具有VM结构的肿瘤往往恶性程度高、血道转移早、预后差。因黑色素瘤中VM的发生率较高,且针对内皮细胞的抗肿瘤血管生成药物对肿瘤细胞自身围成的脉管不起作用,因此,明确VM的分子机制,对黑色素瘤的治疗意义重大。本实验第一部分提示,Rictor,哺乳动物雷帕霉素复合体2(mTORC2)的核心成分,在人体黑色素瘤组织中高表达,且与肿瘤复发转移及VM的形成成正相关。但目前对Rictor在黑色素瘤VM中的作用机制尚不清楚,本实验研究中,我们采用基于慢病毒的小RNA干扰技术及一系列分子生物学技术,分析讨论Rictor对黑色素瘤VM的影响及其可能的分子机制,期待能为其临床治疗提供新的思路。研究方法:1)采用免疫组化及CD34/PAS双重染色的方法,分析Rictor在81例人体黑色素瘤组织标本中的表达情况,及其与VM和其余临床病理资料之间的关系。2)采用Western Blotting实验方法首先验证了Rictor质粒降表达Rictor的效率。选择下调显著序列,采用基于慢病毒的小RNA干扰技术,下调人皮肤黑色素瘤A375细胞系及人葡萄膜黑色素瘤MUM-2B细胞系中Rictor的表达水平,研究其下调对黑色素瘤细胞三维成管能力的影响。3)采用MTT实验及流式细胞术检测细胞周期,研究下调Rictor表达对A375及MUM-2B细胞增殖能力和周期的影响。4)采用划痕实验及Transwell迁移实验,观察下调Rictor表达对黑色素瘤A375及MUM-2B细胞迁移能力的影响;采用Transwell侵袭实验,分析下调Rictor表达对A375及MUM-2B细胞侵袭能力的影响;采用粘附实验,分析下调Rictor表达对A375及MUM-2B细胞外基质粘附能力的影响。5)采用Western Blotting,分析Rictor表达下调对其下游关键分子AKT磷酸化的影响及AKT下游MMP-2及MMP-9蛋白表达的影响;采用Real-Time PCR分析Rictor表达下调对MMP-2及MMP-9 mRNA水平的影响;采用明胶酶谱实验分析Rictor表达下调对MMP-2及MMP-9活性的影响。6)为进一步验证Rictor对A375及MUM-2B细胞MMP-2/9的表达及活性的影响是通过Rictor-AKT-MMP-2/9途径,向A375及MUM-2B细胞中加入不同浓度的AKT抑制剂(MK-2206),采用Western Blotting方法分析抑制AKT对其下游MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响;且采用明胶酶谱实验方法分析抑制AKT对其下游MMP-2和MMP-9活性的影响。研究结果:1)免疫组化及CD34/PAS双染提示,在81例人体黑色素瘤组织标本中,Rictor高表达组织有57例,其中有36例与复发与转移有关,31例可见VM结构。此外,Rictor阳性组术后生存时间短于Rictor阴性组,预后更差;2)三维成管实验结果显示,与对照组相比,Rictor表达下调抑制了A375及MUM-2B细胞三维管道的形成;3)细胞增殖实验结果显示,Rictor表达下调抑制了A375及MUM-2B细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期进一步证实Rictor对A375及MUM-2B细胞增殖的影响具体表现为G2/M期细胞阻滞,大量细胞堆积于G2期(DNA合成后期)而不能进入M期(有丝分裂期)使得细胞增殖受到影响;4)划痕、Transwell迁移侵袭及粘附实验结果显示,下调Rictor表达能抑制A375及MUM-2B细胞迁移侵袭能力及对细胞外基质的粘附能力;5)Western Blotting结果显示,Rictor降表达能抑制下游AKT 473位点及308位点的磷酸化,同时抑制了AKT下游MMP-2及MMP-9蛋白水平的表达;Real-Time PCR结果显示,Rictor降表达亦能抑制MMP-2和MMP-9 mRNA水平的表达;明胶酶谱实验结果显示,下调Rictor的表达能抑制A375及MUM-2B细胞MMP-2和MMP-9的活性;6)Western Blotting结果显示,采用不同浓度的AKT抑制剂对AKT进行抑制后,其下游MMP-2和MMP-9蛋白的表达受到抑制;同时明胶酶谱结果提示,抑制AKT能抑制MMP-2和MMP-9的活性。研究结论:1)黑色素瘤中存在VM,且VM结构与黑色素瘤的不良预后呈正相关Rictor在人体黑色素瘤组织中呈高表达,且其表达与肿瘤的复发转移及VM呈正相关,与患者的生存时间呈负相关,提示Rictor是黑色素瘤预后不良的指标之一。2)Rictor、AKT及MMP-2在人体黑色素瘤中均呈高表达。且Rictor(+)、AKT(+)、MMP-2(+)及VM结构的存在,均与黑色素瘤的预后生存时间呈负相关,提示Rictor、AKT、MMP-2及VM均为黑色素瘤不良预后的指标;3)在A375及MUM-2B黑色素瘤细胞中,Rictor下调可通过抑制细胞增殖(G2/M阻滞)、运动及对细胞外基质的粘附能力而抑制细胞的三维成管能力,进而抑制VM的形成。4)进一步研究发现,Rictor对VM的调控,是通过调节其下游AKT磷酸化,进而调控AKT下游MMP-2和MMP-9的表达及活性来实现的。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5

【参考文献】