基于羧甲基壳聚糖水凝胶培养人表皮黑素细胞的实验研究

发布时间：2020-04-03 09:21

【摘要】：研究背景及目的白癜风是临床上常见的一种色素脱失性皮肤疾病,发病机制尚不明确。临床上将白癜风分为进展期和稳定期。对于稳定期或者顽固的白癜风患者,临床经常采用外科治疗,通常包括自体移植、黑素细胞悬液移植、针刺、表皮磨削术等。其中,黑素细胞悬液移植原理是将黑素细胞直接移植于白癜风脱色部位,以达到复色目的。但细胞悬液的流动性容易导致移植细胞流失或者分布不均,导致复色结果不理想。根据组织工程学原理,可利用生物材料定植搭载黑素细胞完成移植过程。本实验采用京尼平交联羧甲基壳聚糖制成水凝胶,培养人原代表皮黑素细胞。通过对不同配比制得的羧甲基壳聚糖水凝胶(CMCS-GEL)进行理化性质测量,以及检测接种于CMCS-GEL上原代黑素细胞的生长及增殖情况。探究出CMCS-GEL最适宜的制备条件,评估CMCS-GEL的生物相容性,为白癜风的临床治疗提供实验依据。方法将3%羧甲基壳聚糖水溶液与0.1%京尼平水溶液以1:0.5,1:1,1:1.5体积比混合,37℃恒温交联24小时,编号为GEL-1,2,3,制得厚度约为0.2cm的灰蓝色水凝胶。羧甲基壳聚糖交联京尼平水凝胶(CMCS-GEL)的理化性质测量:傅里叶红外光谱仪(FTIR)分别对羧甲基壳聚糖、京尼平和CMCS-GEL进行检测分析;扫描电镜下观察CMCS-GEL形貌;旋转流变仪测量各组CMCS-GEL的储存模量G'和损耗模量G”;将冻干后的CMCS-GEL置于恒温水中,间断称重,计算各组CMCS-GEL溶胀率。羧甲基壳聚糖交联京尼平水凝胶(CMCS-GEL)的生物相容性与抗菌性测量:培养人原代表皮黑素细胞,并接种于各组CMCS-GEL上,CCK-8法检测黑素细胞活性情况;光学显微镜及环境扫描电镜下观察CMCS-GEL上黑素细胞生长情况;细胞免疫荧光检测CMCS-GEL上黑素细胞S-100蛋白表达。结果1.根据傅里叶红外光谱仪(FTIR)结果可见,对比京尼平和羧甲基壳聚糖红外图谱,CMCS-GEL中化学基团和化学键变化表示基团之间进行反应,交联反应完成。2.扫描电镜下,CMCS-GEL呈海绵蜂窝状三维网络结构,孔径大小约为50μm。3.流变学结果显示,各组CMCS-GEL G'与G”随频率变化而保持稳定,且G'G”,均符合水凝胶的特征。GEL-1,2的屈服应力值明显高于GEL-3,GEL-2组显示出比其余组别更好的抵抗应力能力。4.GEL-1,2,3溶胀率依次递减,分别约为350%,275%和248%,各组CMCS-GEL有较强的吸水能力。5.通过连续3日CCK-8法测量黑素细胞在CMCS-GEL上黑素细胞生长情况:GEL-1,2,3组在24小时细胞活性分别为0.975,0.98,0.892;48小时细胞活性为0.94,0.976,0.847;72小时细胞活性为0.848,0.969,0.748,并进行统计学分析,差异无统计学意义(P0.05)。GEL-1,2,3细胞活性呈现总体下降趋势,GEL-2组下降趋势最为轻微。6.光学显微镜及环境扫描电镜下观察CMCS-GEL上黑素细胞生长情况:光学显微镜下显示黑素细胞于接种8小时后即可贴壁。接种48小时的黑素细胞细胞核较大,树突较短,核/质较大。随着黑素细胞的生长,核/质减小,树突变细变长,可见典型的黑素细胞形貌。7.S-100细胞免疫荧光显示S-100蛋白均表达于普通培养板和GEL-2上的黑素细胞胞质中。普通培养板上黑素细胞树突细长,胞体较小,相邻细胞交织成网。CMCS-GEL上接种的细胞轮廓稍模糊,胞体较大,树突数量不如普通培养板多。结论羧甲基壳聚糖-京尼平水凝胶(CMCS-GEL)具有抵抗应力的能力,并具有较强的吸水性。良好的生物相容性可以使黑素细胞正常生长并保持细胞形态,维持黑素细胞正常功能。
【图文】：

逦ＮＨＣＨ，ＣＯＯＨ邋ＮＨ，糖（Ｏ－ＣＭＣＳ）逦Ｎ袭甲基壳聚糖（Ｎ．ＣＭＣＳ）逡逑「邋ＣＨ２ＣＫ１．ｈＣＯＯＨ邋ＣＨ２ＯＨ逦＾逡逑Ｊ—＼＼＼邋ｈ／＾°＼Ｎ逡逑／ｏｈ邋ｎ邋Ｖ邋（邋ｏｈ邋ｙ逡逑ｔ；逡逑ｎｈ２逦ｎｈｃｈ＾ｃｏｏｈ逡逑ｎ，ｏ－羧甲基壳聚糖（ｘｏ－ｃｍｃｓ）逡逑基壳聚糖，，Ｎ－羧甲基壳聚糖，Ｎ，0－羧甲基壳聚糖结ｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋Ｏ－Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ邋Ｃｈｉｔｏｓａｎ，邋Ｎ－邋Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ邋Ｎ？０－邋Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ邋Ｃｈｉｔｏｓａｎ逡逑

戊二醛逦京尼乎逡逑来邋源逦化学合成逦生物提取逡逑价格逦较低逦高逡逑交联能力逦较好逦好逡逑交联结构逦网状结构逦环状结构逡逑交联制品的稳定性逦一舨逦好逡逑细胞毒性（基因＃性）逦高逦很低逡逑生物相容性逦较差逦好逡逑抗降解能力逦逦较好逡逑表１戊二醛与京尼平的比较逡逑Ｔａｂ．ｌ邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ邋ａｎｄ邋ｇｅｎｉｐｉｎ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.41

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本文编号：2613186