地高辛衍生物干预小鼠银屑病的初步研究

发布时间：2017-03-25 15:14

  本文关键词：地高辛衍生物干预小鼠银屑病的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 银屑病是由多种细胞(真皮中的树突细胞、巨噬细胞和T细胞,表皮中的中性粒细胞和一些T细胞)和细胞因子共同参与的慢性炎症性皮肤病,效应性辅助性T细胞(Th)在银屑病的免疫应答中起着重要作用。近年来研究发现一种异于Th1、Th2的CD4(+)辅助性T效应细胞的亚群Th17细胞,Th17细胞及其效应分子与包括银屑病在内的多种自身免疫性疾病的发病密切相关。Thl7细胞分泌的特征性细胞因子IL-17能协同IFNγ通过人类角质形成细胞,增加前炎症细胞因子的产生；IL-17还通过在炎症部位上调多种趋化因子如CXCL1、CXCL8和IL-8,诱导中性粒细胞、单核细胞的迁移和增强它们的吞噬功能,进而促进炎症介质释放；另外IL-17刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生炎症细胞因子IL-6、急性反应蛋白和粒细胞集落刺激因子和地诺前列酮等效应分子,参与皮肤炎症过程,形成持续性炎症反应；因此IL-17对皮肤炎症的发生发展起了重要作用。IL-23可以维持Th17细胞的增殖和分化,Th17细胞分泌的细胞因子中IL-6、IL-17以及TNF-α反过来促进IL-23R的mRNA表达增多。IL-23与IL-23R结合后可以通过JAK途径激活STAT3,诱导Th17细胞分化分泌相关细胞因子形成正反馈。 维甲酸相关孤独受体γt(retinoic acid-related orphan receptor γ t, ROR γt)的编码基因Rorc位于人1号染色体上,由10个外显子及9个内含子组成,其mRNA长度为3054bp。RORγt属于配体依赖性转录调节因子,与配体结合后可以在细胞核内调控特定基因的表达。其主要表达于TCR γδ、淋巴组织诱导细胞(LTi)、小肠LTi样细胞及未成熟的胸腺细胞,小肠固有膜T细胞亚集也有少量表达。RORγt是Th17细胞的特异性转录因子,参与Th17细胞分化的启动阶段和维持Th17增殖,RORγt会与IL-17启动子结合,从而上调初始CD4+T细胞中IL-17表达。在人体内尚未发现与RORγt特异性结合的配基,RORγt作为Th17细胞分化的关键转录激活因子,在自身免疫疾病中起着桥梁作用,我们提出把RORγt作为一个新的靶点,利用药物负向调控Th17细胞分化。低浓度的TGF-β联合IL-2、IL-21可以上调IL-23R表达,高水平IL-23通过与细胞表面的IL-23R结合,协同IL-6激活STAT3及增强RORγt的转录,RORγt参与Th17细胞分化的启动阶段,与IL-21协同扩大Th17细胞的分化规模,促进IL-17等因子的表达从而维持Th17增殖。Huang等发现RORγt上调Bcl-xL基因的表达,并增加CD4+CD8+胸腺细胞的存活率；在外周血循环中,RORγt诱导前炎症T细胞向Th17细胞的分化,从而调节IL-17的分泌。研究还表明敲除了RORγt基因的小鼠的初始T细胞未能成功分化为Th17细胞。 地高辛是临床上常用的强心药,最新研究发现它也是一种RORγt拮抗型配基,与激动型配体竞争LBD,结合于H3及H11螺旋之间的囊腔,并扰舌LRORγt的激活结构螺旋H12,从而拮抗RORγt激活因子的相互作用,干扰RORγt的转录活性,抑制Thl7细胞的分化,降低IL-17的分泌量,抑制IL-23R、IL-17a、IL-17f、IL-22的基因转录,减轻机体炎症反应,而且对其他核受体如RORα、DHR3、DAF-12及LXRα等均无影响,研究证实地高辛只对Th17细胞发挥作用,而对其他T细胞系如Th1、Th2和Treg细胞等无影响,抑制RORγt的转录活性但对其他的核激素受体如]RORα、DHR3、DAF-12及LXRα等均没有影响,地高辛对RORγt的抑制存在很高的特异性。尽管地高辛具有一定的心脏毒副作用,但它的衍生物20,22-氢地高辛-21,23-二醇(dhd)也能非常有效地抑制Th17细胞的分化和IL-17的表达,我们的前期研究显示地高辛衍生物能够选择性拮抗RORγt转录活性,而对RORα和RORβ分子构象和转录活性没有影响,说明它与RORγt靶向结合的特异性也很高。地高辛衍生物在血药浓度达到40μM时也未发现其对人细胞存在毒性作用,因此地高辛衍生物可以作为一个高效、低毒、特异性高的靶向抑制剂,是非常有潜力的Th17抑制性药物。 Th17与银屑病发病关系密切,通过抑制Th17的分化可以减轻银屑病的皮肤炎症反应,而能靶向抑制Th17特异转录因子RORγt的地高辛衍生物可以作为有效抑制Th17的新药物,成为阻止银屑病皮肤炎症发展的重要治疗方法。 研究目的： 本研究的目的是通过体内实验验证小分子化合物地高辛衍生物对银屑病的治疗作用,同时确认RORγt为治疗银屑病的药物作用靶点。我们使用免疫调节剂咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型,通过小鼠皮肤的大体改变和组织病理学的特征观察作用效果,使用荧光定量PCR检测IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA水平变化,使用免疫印迹技术检测RORyt的蛋白水平变化,为研究银屑病安全、高效的基因靶向治疗药物做出有益的尝试。 实验方法： 1.银屑病小鼠模型的建立和分组处理：8-12周雌性小鼠BALB/c30只随机分为银屑病组,地高辛衍生物处理组和对照组,每组10只,用松下电推剪ER3300去除背部毛。银屑病组第1至6天连续用5%咪喹莫特乳膏62.5mg局部擦拭背部,每天腹腔注射PBS0.01ml/g;地高辛衍生物处理组第1至6天连续用5%咪喹莫特乳膏62.5mg局部擦拭背部,每天腹腔注射地高辛衍生物混悬液,地高辛衍生物使用剂量为40u g／天／只；对照组小鼠背部局部擦拭凡士林代替咪喹莫特,每天腹腔注射PBS0.01ml/g。 2.小鼠背部皮肤取材及病理学处理：各组小鼠第7天断颈椎处死后取背部标本,一部分背部皮肤组织置于-80度冰箱中冻存备用,另一部分用4%多聚甲醛固定,进行酒精脱水,石蜡包埋、切片,一部分切片进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining, HE),另一部分切片对IL-17进行免疫组织化学染色。 3.实时荧光定量PCR检测IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表达水平：取约30mg小鼠背部皮肤提取RNA,逆转录生成cDNA后,以引物β-actin(上游：TGAAGCAGGCATCTGAGGG,下游：CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG);IL-23(上游：GGACTTGTGCTGTTCTTGTTTTGT,下游：CCTGCTCTGGGGTTTGTTTC); IL-17A(上游：TTTTCAGCAAGGAATGTGGA,下游引物：TTCATTGTGGAGGGCAGAC); IL-17F(上游：CAAGAAATCCTGGTCCTTCG,下游引物：GAGCATCTTCTCCAACCTGAA)进行荧光定量PCR检测。计算各标本平均Ct值,以GAPDH作为内参,将IL-23、IL-17A、IL-17F的Ct值减去GAPDH的Ct值作为△Ct值,将银屑病组和地高辛衍生物处理组的△Ct值减去对照组的△Ct值计算出△ACt值。 4. Western blot检测小鼠皮肤组织中的RORγt蛋白的表达：取约30mg小鼠背部皮肤提取蛋白质,BCA法测蛋白浓度计算上样量,聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜,封闭一抗(兔抗小鼠RORγt和β-actin多克隆抗体)、二抗,上机扫描。 5.统计学分析：采用SPSS13.0统计软件统计分析,实验结果用X±s表示。两组比较用方差齐性分析和t检验,多组独立样本比较对总体方差齐且正态分布的计量资料采用方差分析,以P0.05为有统计学意义。 实验结果： 1.小鼠背部皮肤大体临床观察和HE染色：小鼠背部皮肤大体临床观察：对照组在6天的实验中皮肤光滑,无明显变化；银屑病组第2天开始出现红斑、鳞屑且逐渐加重;而地高辛衍生物处理组第4天开始出现轻微的红斑和薄层鳞屑,但实验过程中无明显变化。第7天取小鼠背部皮肤做HE染色,镜下对照组小鼠皮肤组织正常；银屑病组皮肤角化过度、角化不全、棘层肥厚,真皮中明显的炎症细胞浸润；地高辛衍生物处理组与对照组相比,有轻度的角化过度、棘层肥厚和炎症细胞浸润,但比银屑病组明显要轻。 2.小鼠背部皮肤IL-17免疫组化：银屑病组IL-17强表达于表皮全层胞膜和胞浆内,对照组表皮细胞弱染色,部分表达IL-17,两组间有统计学差异(t=48.21,P0.05)；地高辛衍生物处理组与银屑病组相比IL-17表达较弱,两组间有统计学差异(t=22.86,P0.05)；地高辛衍生物处理组与对照组间有统计差异(t=22.85,P0.05)。 3.背部皮肤组织中RORγt的蛋白表达水平：银屑病组与对照组、地高辛衍生物处理组相比,皮肤组织中的RORγt蛋白表达量明显增加(P0.05)；地高辛衍生物处理组RORγt蛋白表达水平较银屑病组所有下降,但与对照组相比仍然较高,两组间比较有统计学差异(P0.05)。 4.背部组织中IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA表达水平：使用2-△△Ct值计算IL-23、IL-17A、IL-17FmRNA的相对表达量。IL-17AmRNA表达：银屑病组是对照组的3.93倍,地高辛衍生物处理组是对照组的1.42倍,银屑病组和地高辛衍生物处理组有统计学差异(P0.01);IL-17FmRNA表达：银屑病组是对照组的4.24倍,地高辛衍生物处理组是对照组的1.38倍,银屑病组和地高辛衍生物处理组有统计学差异(P0.01);IL-23mRNA表达：银屑病组是对照组的7.61倍,地高辛衍生物处理组是对照组的2.31倍,银屑病组和地高辛衍生物组组间有统计学差异(P0.01)。 结论： 1.在BALB/c小鼠皮肤连续外用咪喹莫特乳膏可以诱导出银屑病样炎症。 2.地高辛衍生物可以延缓银屑病发生,减轻疾病的严重程度,显著抑制Th17细胞的特征性细胞因子IL-17在上皮细胞中的表达。 3.地高辛衍生物能抑制皮损中RORγt的表达,通过靶向抑制RORγt功能抑制Th17细胞的分化。 4.地高辛衍生物能抑制在银屑病发病中起重要作用的IL-17A、IL-17F、IL-23的mRNA表达。
【关键词】：银屑病 地高辛衍生物 R O R γ t 皮肤炎症
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-29
• 第一章 地高辛衍生物对咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型的治疗作用29-38
• 一、材料及仪器29-30
• 二、方法及结果30-35
• 三、讨论35-37
• 四、结论37-38
• 第二章 地高辛衍生物对银屑病小鼠RORγt、IL-17A、IL-17F、IL-23分泌表达的影响38-50
• 一、材料及仪器38-40
• 二、方法及结果40-46
• 三、讨论46-49
• 四、结论49-50
• 参考文献50-61
• 缩略语表61-62
• 攻读硕士学位期间主要研究成果62-63
• 致谢63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 钟彩梅;蔡译萱;王美容;郑秀芬;邱贤文;孙乐栋;张帆;张堂德;;分子对接分析地高辛衍生物选择性拮抗RORγt活性[J];南方医科大学学报;2014年04期

2 常树霞;陈永锋;;Th17细胞与银屑病[J];皮肤性病诊疗学杂志;2010年01期

3 Seon Hee Chang;;A novel heterodimeric cytokine consisting of IL-17 and IL-17F regulates inflammatory responses[J];Cell Research;2007年05期

  本文关键词：地高辛衍生物干预小鼠银屑病的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：267400