SB-431542对黑色素瘤细胞增殖及其LDH、Nodal蛋白表达的影响

发布时间：2020-07-25 18:04

【摘要】：目的:探讨低氧环境、Nodal抑制剂(SB-431542)对黑色素瘤细胞增殖的影响;探讨低氧环境、SB-431542对黑色素瘤细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)同工酶亚基(LDH-A、LDH-B)、Nodal(Nodal growth differentiation factor)及其受体ALK4(Activin receptor-like kinase4)、ALK7(Activin receptor-like kinase7)蛋白的表达及LDH同工酶谱的影响;探讨低氧环境、SB-431542是否通过影响LDH、Nodal及其受体的表达来影响黑色素瘤(Malignant melonoma,MM)的发生发展过程;以及探讨LDH、Nodal在黑色素瘤能量代谢方面是否具有相关性;从而为黑色素瘤在临床上的诊断及治疗提供新的思路。方法:在体外使用氯化钴诱导黑色素瘤细胞A375低氧,构建低氧模型,模拟其在人体内生存的微环境。用SB-431542干预细胞,通过MTT法检测低氧环境、SB-431542对A375细胞增殖活性的影响,探索细胞增殖的最适作用浓度及最佳作用时间。采用Western Blot的方法检测低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF-1α)蛋白表达水平,根据其表达水平的高低以明确低氧模型是否制造成功,并检测低氧环境及SB-431542对LDH-A、LDH-B、Nodal及其受体ALK4、ALK7蛋白表达的影响;采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测低氧环境、SB-431542对乳酸脱氢酶同工酶谱活性的影响。结果:1.MTT法检测CoCl_2诱导形成的低氧环境对黑色素瘤A375细胞的增殖的影响:Co Cl_2在适宜浓度范围内(50-200uM)对细胞增殖无明显抑制作用(P0.05),当超过一定的浓度范围(250uM)后随着其作用浓度和作用时间的的增加,表现出抑制作用。当CoCl_2的浓度为150uM时,细胞增殖在48h达高峰。SB-431542对MM细胞增殖的影响:当SB-431542作用浓度逐渐增加,作用时间逐渐延长,细胞的增殖能力呈现下降的趋势。浓度小于10uM抑制作用较弱;浓度为10-20uM表现出一定的抑制作用;当浓度超过30uM后呈现出明显的抑制作用。CoCl_2与SB-431542共同作用对细胞增殖的影响:当SB-431542作用浓度为10uM恒定不变时,CoCl_2的浓度在50-150uM范围内对细胞增殖无抑制作用(P0.05),当CoCl_2浓度超过200uM后表现出明显抑制作用。当SB-431542作用浓度为10uM,同时CoCl_2作用浓度为150uM时,细胞的增殖在48h达最高峰。2.Western Blot技术检测结果显示:适宜浓度的CoCl_2成功诱导A375细胞形成低氧模型后,HIF-1α呈现高表达,同时可见LDH-A、Nodal、ALK4、ALK7蛋白的高表达,LDH-B蛋白低表达(P0.05),SB-431542可上调LDH-B蛋白表达,下调LDH-A、Nodal、ALK4、ALK7蛋白的表达(P0.05)。3.琼脂糖凝胶电泳结果显示:低氧环境可增加LDH同工酶谱中LDH5的活性,而SB-431542可降低LDH5的活性(P0.05)。结论:1.适宜浓度的Co Cl_2在适宜时间可成功诱导黑色素瘤细胞低氧环境模型。低氧环境具有促进黑色素瘤细胞增殖及能量代谢的作用,其机制可能与HIF-1α、LDH-A、Nodal及其受体的高表达,LDH-B的低表达有关。2.SB-431542具有抑制黑色素瘤细胞增殖及能量代谢的作用,其机制可能与LDH-A、Nodal及其受体表达下调,LDH-B表达上调有关。因此,SB-431542有可能成为一种新型的抗黑色素瘤的药物。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5
【图文】：

MTT 法检测黑色素瘤 A375 细胞的增殖情况TT 法检测不同浓度 CoCl2、SB-431542 对黑色素瘤 A375 细胞增殖。.1 CoCl2对黑色素瘤 A375 细胞增殖的影响各组 CoCl2干预人 MM 细胞形态无变异。在不同的时间分别测定吸光光度值，结果见图 1-1。采用单因素方差分析，方差齐性检验 0.138＞0.05，证明方差是齐性的。F 值为 4.298，P<0.05，差异有意义。组间两两进一步分析，24h 与 48h 相比较，差异具有统计学P<0.05）；48h 与 72h 相比较差异具有统计学意义（P<0.05）； 72h 间差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

CoCl2处理浓度（umol/L)图 1-2 CoCl2对 MM 细胞增殖活性的影响(*P<0.05,**P<0.01)igure1-2：The effect of hypoxia induced by CoCl2at different concentration on prof human MM cells in groups and times.2 SB-431542 对黑色素瘤 A375 细胞增殖的影响各组 SB-431542 干预 MM 细胞形态无变异。在不同的时间分别的吸光光度值，结果见图 2-1。单因素方差分析显示，方差齐性为 0.169＞0.05，说明方差是齐性的。F 值为 11.001，P<0.05，差学意义。组间两两进一步分析显示，24h 与 48h 相比较，差异有义（P＜0.05）；24h 与 72h 相比，差异具有统计学意义（P＜0.05 72h 相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

CoCl2处理浓度（umol/L)图 1-2 CoCl2对 MM 细胞增殖活性的影响(*P<0.05,**P<0.01igure1-2：The effect of hypoxia induced by CoCl2at different concentration oof human MM cells in groups and times.2 SB-431542 对黑色素瘤 A375 细胞增殖的影响各组 SB-431542 干预 MM 细胞形态无变异。在不同的时间的吸光光度值，结果见图 2-1。单因素方差分析显示，方差为 0.169＞0.05，说明方差是齐性的。F 值为 11.001，P<0.05学意义。组间两两进一步分析显示，24h 与 48h 相比较，差义（P＜0.05）；24h 与 72h 相比，差异具有统计学意义（P＜ 72h 相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

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