西兰花异硫氰酸酯提取及诱导小鼠黑色素瘤B16细胞自噬的分子机制研究

发布时间：2020-08-19 17:14

【摘要】：西兰花种子中的硫代葡萄糖苷(GLS)经黑芥子酶或硫苷酶水解可得到具有多种生物活性的异硫氰酸酯(ITCs),其中的4-甲硫基丁基异硫氰酸酯(Erucin)和萝卜硫素(Sulforaphane,SF)具有防癌和抗癌的作用,SF的抗癌活性比Erucin更高。为了提高西兰花种子中ITCs中活性物质的含量以及研究萝卜硫素诱导小鼠黑色瘤B16细胞自噬的分子机制,本论文以西兰花和小鼠黑色素瘤B16细胞为对象,研究了提取方式对西兰花种子中ITCs含量的影响、不同清炒方式对西兰花ITCs含量及对B16细胞中醌氧化还原酶(NQO1)活性的影响,以及初步探讨了SF诱导B16细胞自噬的分子机制。主要结果如下:(1)以西兰花种子为研究对象,研究先酶解再提取(Enzymatic hydrolysis before extraction,EBE)、酶解和提取同时进行(Enzymatic hydrolysis and extraction simultaneously,EES)两种方式对提取液中ITCs含量的影响。结果表明,以西兰花种子为原料时,EBE组与EES组中的总ITCs的含量无显著性差异(P0.05),但EES组中的Erucin含量显著提高(P0.05)。以未纯化黑芥子酶和萝卜硫苷为研究对象也得出类似结论。但是以纯黑芥子酶和萝卜硫苷为研究对象时,两种提取方式对提取液中ITCs和Erucin含量无显著影响(P0.05)。(2)清炒是我国常用的西兰花烹饪方法。本论文以小鼠黑色素瘤B16细胞为对象,研究新鲜西兰花(Raw broccoli,RB)、直接炒西兰花(Direct stir-fried broccoli,DS)、酶解后再炒的西兰花(Hydrolyzed and sir-fried broccoli,HS)的提取物对ITCs含量的影响、对小鼠黑色素瘤B16细胞抑制作用,以及对B16细胞醌还原酶(Quinone reductase,QR/NAD(P)H:reductase 1,NQO1)活性的诱导作用。结果表明,各组西兰花提取物对B16细胞的抑制作用无显著差异(P0.05);RB和HS组提取物能显著提高ITCs含量和B16细胞NQO1的活性,与DS组存在显著性的差异(P0.05)。(3)利用免疫荧光细胞化学染色法检测SF对B16细胞自噬小体形成的影响,结果发现5μM、10μM的SF对自噬小体的形成无明显影响,20μM和30μM的SF能明显促进B16细胞自噬体的生成。(4)研究了SF对B16细胞中的Atg5、LC3蛋白的表达以及SF诱导B16细胞自噬与PI3K/ERK/AMPK信号通路的关系,结果表明,SF能上调Atg5和LC3蛋白的表达,SF可通过PI3K/ERK信号通路诱导B16细胞自噬,PI3K/ERK/AMPK信号通路抑制剂能促进SF诱导B16细胞凋亡的作用,但当SF的浓度较低时,抑制AMPK信号通路对B16的细胞凋亡无明显的影响。
【学位授予单位】：浙江科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.5;TS255.1
【图文】：

异硫氰酸酯,生物活性,黑芥子,氰酸

图 1.1 硫苷的结构Fig 1.1 Structure of glucosinolates生物活性咀嚼、机械破碎时，GLS 被内源性黑芥子泛的生物活性，既包括有益的，也包括有害异硫氰酸酯作为典型的亲脂类物质，能透过响细胞的代谢功能，抑制微生物的增殖[10]物的作用[11]。王岩等人以金黄色葡萄球菌和氰酸苄酯（BITC）、异硫氰酸苯乙酯（PEI两种菌的生长有明显的抑制效果[12]。从芥子黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞作用，且对革兰氏阳性菌的抑制能力明显强菌特性，为异硫氰酸酯作为抗菌剂提供了理

信号通路,抑制剂,蛋白表达,自噬

过 Western blot 检测自噬标志性蛋白 LC3II 和 LC3I 条带的浓度可以反映自噬的程度。LY294002 是首个合成的已知抑制 PI3K / /β 的小分子，不仅能够结合 classI PI3Ks 和其他 PI3K 相关的激酶，还能够结合一些与 PI3K 家族无关的新型靶点，因此常用来作为 PI3K 信号通路的抑制剂。采用不同浓度的 SF（有无 PI3K 信号通路抑制剂）作用 B16 细胞 24 h，RAPA、3-MA 分别为阳性对照和阴性对照，从图中可以看出（图 4.2），空白对照组（0μM，仅含培养基）与各实验组（SF 浓度分别为 5 μM、10 μM、20 μM、30 μM）相比，LC3I、LC3II 蛋白的表达随着药物浓度的增加，表现出逐渐增强的趋势，而加入了 LY49002 的 SF 作用细胞，LC3I、LC3II 的表达明显低于只有 SF 作用的细胞，并且 LC3II 相对于 LC3I 的灰度降低，抑制 PI3K 信号通路可降低 B16细胞的自噬水平，说明 SF 能通过 PI3K 信号通路诱导 B16 细胞自噬。低浓度 SF作用 B16 细胞，Atg5 蛋白变化不显著，20 μM、30 μM 的 SF 作用细胞后，Atg5条带明显增强。

信号通路,抑制剂,蛋白表达,自噬

PD98059 是一种选择性的和可逆的 ERK 通路的抑制剂，作用于基底 MEK（GST-MEK1）和部分激活的 MEK（218 和 222 残基由丝氨酸突变为谷氨酸，GST-MEK-2E）。实验中选取两组细胞，第一组为 5 μM、10 μM、20 μM、30 μM的 SF、第二组加了 ERK 信号通路抑制剂的各浓度的 SF，RAPA、3-MA 为阳性对照和阴性对照以及空白组（只含培养基），从图中可知（图 4.3），不含 ERK信号通路的 SF 组和加 ERK 信号通路的 SF 组，LC3I、LC3II 以及 Atg5 蛋白的表达随 SF 浓度增高依次增加，RAPA 诱导了 B16 细胞的自噬，3-MA 抑制了 B1细胞的自噬水平，只加 ERK 信号通路抑制剂的细胞组，降低 LC3I 蛋白的表达、对 LC3II 蛋白无显著作用，增强了 Atg5 蛋白的表达，结果表明，抑制 ERK 信号通路，可抑制莱菔硫烷诱导的细胞自噬，表明 ERK 信号通路在莱菔硫烷诱导细胞自噬中起重要作用。

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